首页 > 文献资料
-
耐辐射球菌pprI基因真核表达载体的构建及其抗辐射作用
目的 研究耐辐射球菌pprI原核基因的真核表达载体的构建及其转染对离体真核细胞急性放射损伤的防护作用.方法 应用DNA重组技术构建pEGFP-c1-pprI质粒;采用脂质体转染技术分别将空载体质粒pEGFP-c1和重组质粒pEGFP-c1-pprI转入人肺上皮细胞系Beas-2B细胞,筛选稳定转染细胞系;应用集落形成实验检测受照转染细胞的生存能力;流式细胞仪检测细胞周期和凋亡率的变化;荧光显微镜观察受照细胞ROS荧光强度;免疫荧光实验观察受照细胞不同时间γ-H2AX焦点数目.结果 成功地构建了pprI原核基因的真核表达载体,并在Beas-2B细胞中表达了PprI融合蛋白,建立了稳定转染细胞系.与空白对照组和空载体组相比,细胞克隆生存曲线显示转染了pprI基因的Beas-2B细胞经不同剂量辐射,其存活分数SF增加,该曲线参数D0、Dq、N增高;转染了pprI基因的Beas-2B细胞受照后的ROS的荧光强度和不同时间(1、2、4 h) γ-H2AX的焦点数均显著减低(F=16.73、19.47、6.94,P＜0.05);此外,该细胞G2期阻滞(F=139.73、237.92,P＜0.05)和凋亡率显著减低(F=626.02、2 052,P＜0.05).结论 耐辐射球菌pprI原核基因可在离体真核细胞中稳定表达,并且显著提高受照真核细胞的辐射抗性.
-
耐辐射球菌pprI基因对γ射线损伤小鼠的抗辐射机制
目的 研究耐辐射球菌pprI基因活体电转染在哺乳动物γ射线放射损伤中发挥抗辐射作用的机制.方法 采用雄性昆明种小鼠,随机区组法分为健康对照组、单纯照射组、空载体转染组和基因转染组.将自行构建的含有pprI基因的pCMV-HA-pprI质粒注入接受6 Gyγ射线照射的小鼠肌肉内,然后采用活体基因电转导技术将该基因导入细胞内,应用Western blot法对PprI蛋白及其下游基因recA在哺乳动物细胞中的同源类似物Rad51以及Rad52蛋白表达进行检测.结果 照后1d基因转染组小鼠肌肉组织中PprI蛋白明显表达,7d后未见蛋白表达,其余组小鼠未见蛋白表达；在基因转染组小鼠,肺脏Rad51蛋白于照后第1、7和14天明显表达,明显高于单纯照射组及空载体转染组小鼠,肝脏Rad51蛋白于照后第1天和第28天明显表达,肾脏Rad51蛋白于照后第1天及第14天明显表达；在各组小鼠的肺脏、肝脏组织中检测了Rad52蛋白,其表达无明显规律.结论 耐辐射球菌pprI原核基因成功地在哺乳动物体内细胞表达了PprI蛋白,并作用于下游基因recA在哺乳动物细胞中的同源类似物rad51基因,使其蛋白表达显著增高而发挥其抗哺乳动物辐射损伤的作用.
-
原核pprI基因活体转染对BALB/c小鼠急性放射损伤保护作用的研究
目的 研究耐辐射奇球菌pprI基因活体转染对小鼠急性放射损伤的防护作用.方法 采用SPF级纯品系BALB/c雄性小鼠,应用活体电转染技术,将pEGFP-c1空载质粒及pEGFP-c1-pprI基因重组质粒转入小鼠股前肌肉.应用60Coγ射线进行全身照射,死亡率观察组吸收剂量为6 Gy,观察照后30 d内小鼠死亡率的变化;放射效应观察组吸收剂量为4 Gy,于照后1、7、14、28和35 d观察小鼠外周血象、胸腺、脾脏和骨髓细胞的凋亡率,并于照后第7和28天观察小鼠肺脏和睾丸组织的病理变化.结果 质粒注射剂量为50 μg/50μl,电场强度为200 V/cm时转染肌细胞的效率高.pEGFP-c1-pprI基因重组质粒转染组小鼠急性辐射死亡率为30％,显著低于单纯照射组(60.0％)和空载体组(63.3％)(x2=4.90、6.24,P＜0.05).与单纯照射组、空载体组比较,pEGFP-c1-pprI基因重组质粒转染组小鼠的外周血白细胞计数在照后1、7、14和28 d显著增高(F=16.26、8.10、6.37、10.74,P＜0.05),血小板计数在照后第7和14天显著增高(F=7.36、5.71,P＜0.05),淋巴细胞百分率在照后7d显著增高(F=18.43,P＜0.05);胸腺和骨髓细胞凋亡率均在照后第1、7、14、28和35天显著降低(F=3.88、14.91、14.14、39.86、5.65,P＜0.05;F=53.70、11.75、21.78、41.40、4.54,P＜0.05);脾脏细胞凋亡率在照后第1、7、14和28天显著降低(F=97.95、56.61、33.55、14.71,P＜0.05).pEGFP-c1-pprI基因重组质粒转染组小鼠肺脏和睾丸的放射病理损伤较轻并且恢复较快.结论 耐辐射奇球菌pprI基因活体电转染对BALB/c小鼠急性放射损伤具有显著的保护作用,为进一步临床应用奠定了实验基础.
-
原核pprI基因活体转染对系统性红斑狼疮小鼠氧化应激的影响
目的:通过检测耐辐射奇球菌pprI基因活体转染系统性红斑狼疮(SLE)小鼠的氧化应激和疾病活动性指标,探讨其对SLE小鼠氧化应激状态的影响.方法:62只纯品系B6.MRL-FaslprNJU雌性小鼠随机分成3组,未转染组(20只),pEGFP-c1空载体转染组(20只),pEGFP-c1-pprI转染组(22只),纯品系C57BL/6健康小鼠作为健康对照组(20只).应用活体电转染技术将pEGFP-c1空载体及pEGFP-c1-pprI基因重组质粒转入SLE小鼠股前肌肉.Western blot鉴定转染后SLE小鼠外周血pEGFP-c1和pEGFP-c1-pprI融合基因表达.采用化学比色法检测各组小鼠外周血氧化应激标志物,ELISA法检测抗dsDNA抗体,免疫比浊法检测补体C4和C-反应蛋白.结果:①Western blot检测结果提示,质粒转染一周后均能在小鼠体内成功表达,且无毒副作用;②与未转染质粒和pEGFP-c1转染组SLE小鼠相比,pEGFP-c1-pprI转染组SLE小鼠GSH含量显著升高(P<0.01),丙二醛(MDA)、蛋白质羰基(Carbonyls)和氧化型谷胱甘肽(GSSG)含量显著降低(P<0.01),超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)活性明显升高(P<0.05),血浆抗dsDNA抗体滴度和CRP含量显著降低(P<0.01),补体C4明显升高(P<0.05),与健康组相比,各项指标差异无统计学意义(P>0.05);③与未转染质粒和pEGFP-c1转染组SLE小鼠相比,pEGFP-c1-pprI转染组SLE小鼠淋巴细胞凋亡率和死亡率明显下降(P<0.01),与健康小鼠相比,差异无统计学意义(P>0.05).结论:耐辐射奇球菌pprI基因活体转染后能在SLE小鼠体内稳定表达且能调节体内的氧化应激状态,降低SLE小鼠的疾病活动度.
