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一叶萩碱的高效毛细管电泳手性分离及其大鼠体内立体选择性代谢研究
目的建立一叶碱(SE)的高效毛细管电泳手性分离方法.方法以羟丙基-β-环糊精(HP-β-CD)为手性选择剂,测定条件为:分离介质32 mmol·L-1 HP-β-CD的Tris-H3PO4缓冲液(40 mmol·L-1,H3PO4调至pH 6.0);分离电压15 kV,柱温16℃,压力进样6 s,检测波长254 nm;大鼠各生物样品碱化后乙酸乙酯萃取.结果测定条件下SE基本达到基线分离,大鼠生物样品测定不受内源及代谢物干扰.大鼠ip SE经胆汁、尿和粪排泄以d型为主,具有立体选择性.结论本法简便可靠,可适用于SE在大鼠体内立体选择性代谢研究.
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重组人和大鼠醇脱氢酶、醛-酮还原酶的克隆表达及应用
克隆、表达人和人鼠醇脱氢酶(ADH)、醛一酮还原酶(AKR)基因全长cDNA,研究扁桃酸(MA)代谢机制.设计引物,利用RT-PCR克隆人和大鼠醇脱氧酶、醛-酮还原酶基因全长cDNA.测序正确的cDNA被克隆到表达载体pET-28a(+)上并在大肠杆菌BL21(DE3)中稳定表达.利用亲和色谱纯化相应的酶,通过检测其在340 nm吸收度值的变化进行酶活性测定.获得的醇脱氢酶与扁桃酸,醛-酮还原酶与苯乙酮酸(PGA)共孵育,采用HPLC分析其代谢和转化情况.通过测序,目的蛋白的cDNA序列完全正确,在宿主菌中获得良好的可溶性表达,经Ni2+亲和柱纯化后目的蛋白达到了电泳纯,具有较好的催化活性.人ADH2对扁桃酸的代谢具有立体选择性,优先代谢S-MA,对S-MA的代谢能力较强.大鼠ADH1对扁桃酸无代谢活性,人和大鼠AKR对苯乙酮酸均无代谢.成功构建人和大鼠醇脱氢酶、醛-酮还原酶的表达质粒,获得高活性的蛋白.这些重组酶模型可以用于由醇脱氢酶和醛-酮还原酶介导的药物代谢研究.
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在大鼠肝微粒体中反式曲马朵和反式氧去甲基曲马朵对映体代谢的性别差异
目的研究反式曲马朵(trans T)对映体代谢,反式氧去甲基曲马朵(M1)对映体生成及其与葡糖醛酸结合的性别差异.方法以trans T或M1为底物分别与大鼠肝微粒体孵育,高效毛细管电泳法测定孵育液中trans T和M1对映体.结果与(+)-对映体相比,(-)-trans T优先代谢,(-)-M1优先生成.在雌性大鼠肝微粒体中(-)-M1优先与葡糖醛酸结合;M1两对映体生成及其与葡糖醛酸结合的CLint比值偏离1的程度较大.在雄性大鼠肝微粒体中(+)-M1优先与葡糖醛酸结合.结论Trans T代谢,M1生成及其与葡糖醛酸结合均具立体选择性和性别差异;M1生成及其与葡糖醛酸结合立体选择性的程度以雌性大鼠的较高.
