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酵母工程菌制备紫穗槐-4,11-二烯的研究
构建了两种能产生紫穗槐-4,11-二烯的酿酒酵母工程菌,其中附加体型工程菌W303-1B[pYeDP60/G/ADS]含有表达载体pYeDP60/G/ADS.整合体型工程菌W303-1B[rDNA:ADS]是将ADS基因的表达盒序列通过同源重组的方式整合到酿酒酵母W303-1B基因组中.GC-MS检测发酵产物,结果表明这两种工程菌均能产生紫穗槐-4,11-二烯,但附加体型工程菌产生的紫穗槐-4,11-二烯的产量要高于整合体型工程菌的产量.Southern杂交检测表明,ADS基因以单拷贝的形式整合到W303-1B基因组中,低于附加体型工程酵母中的ADS基因拷贝数.这些结果表明,ADS基因的拷贝数与酵母工程菌中紫穗槐-4,11-二烯的产量呈正相关.
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紫穗槐-4,11-二烯合酶及其代谢工程研究进展
紫穗槐-4,11-二烯合酶催化FPP(farnesyl pyrophosphate,法尼基焦磷酸)生成青蒿素前体紫穗槐4,11-二烯.是青蒿素生物合成途径中的关键酶.本文对紫穗槐-4,11-二烯合酶的分子生物学和代谢工程研究进行了综述.紫穗槐-4,11-二烯合酶编码基因及其相关核酸序列已经得到了克隆.紫穗槐-4,11-二烯合酶cDNA全长1 641bp,编码546 aa.紫穗槐-4,11-二烯合酶适pH范围较宽,但需要二价金属离子作为辅酶才能发挥作用,其产物和底物的特异性不高.在紫穗槐-4,11-二烯合酶作用下,FPP首先进行的足1,6-合环,然后是1,1O-合环,形成紫穗槐-4,11-二烯.由于紫穗槐-4,11-二烯介酶在青蒿素生物合成中具有重要的意义,自从其基因被克隆测序后,先后被导入E.coli、S.cereviseae、烟草、拟南芥和A.nidulans,获得了能产生紫穗槐-4,11-二烯的各种工程菌或细胞,研究通过不同方式提高工程菌中紫穗槐-4,11-二烯产量的方法.
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HMG-CoA还原酶和FPP合酶基因拷贝数对紫穗槐-4,11-二烯酵母工程菌产量的影响
从青蒿中克隆了紫穗槐-4,11-二烯合酶基因(ADS),从酿酒酵母中克隆了HMG-CoA还原酶(HMGR)催化结构域和FPP合酶(FPPS)基因.构建含ADS基因的酿酒酵母表达载体pYeDP60/G/AS,将其转入酿酒酵母,获得能产生紫穗槐-4,11-二烯的酵母工程菌,以朱栾倍半萜为参照,产量为10 μg·L-1.另外构建了含HMGR和FPPS基因的酵母表达载体pGBT9/A/HMG/G/FPP,将该载体和pYeDP60/G/AS共转入酿酒酵母,得到第二个能产生紫穗槐-4,11-二烯的酵母工程菌,产量为23.6 mg·L-1,结果表明增加HMG-CoA还原酶和FPP合酶基因的拷贝数能显著增加酵母工程菌的紫穗槐-4,11-二烯产量.
关键词： 紫穗槐-4 11-二烯 HMG-CoA还原酶 FPP合酶 酵母工程菌
