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肝素寡糖抑制血小板衍生生长因子诱导平滑肌细胞增殖机制的研究
本实验研究了肝素寡糖(HDO)对血小板衍生生长因子(PDGF)诱导血管平滑肌细胞(VSMCs)增殖的影响,并对其作用机制进行初步探讨.实验分为空白组、模型组及肝素寡糖组.采用MTT法和流式细胞仪检测HDO对VSMCs增殖活性及其细胞周期分布影响,Western blot、免疫组化和RT-PCR检测PKC、MAPK、Akt/PI3K信号通路中PKC-α、p-Akt、p-ERK 1/2、p-GSK-3β和p-PDK1等关键蛋白及c-fos、c-myc、c-jun等原癌基因的表达水平,结果显示,HDO (0.01、0.1和1μmol·L-1)可浓度依赖性抑制30 ng·mL-1 PDGF诱导的VSMCs增殖活性,阻滞细胞周期G1/S期转换,并下调信号通路中关键蛋白及原癌基因表达(均为P＜0.05).结果提示,HDO可能通过抑制信号通路中关键蛋白的表达水平从而抑制原癌基因表达和G1/S期转换,进而抑制VSMCs增殖.
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肝素寡糖通过抑制PKC-α影响血管平滑肌细胞增殖的作用
为考察肝素寡糖对血管平滑肌细胞增殖的抑制作用,并探索其相关细胞内信号转导机制,采用cell-based ELISA法、RT-PCR法、Western blotting法和免疫细胞化学法检测细胞内PKC-α蛋白水平和mRNA水平；采用RT-PCR法检测c-jun、c-myc和c-fos等3种原癌基因的mRNA水平.结果显示,肝素寡糖可以抑制新生牛血清诱导的PKC-α和原癌基因的表达,这可能是肝素寡糖抑制血管平滑肌细胞增殖的机制之一；流式细胞实验结果显示,肝素寡糖能将细胞阻滞于G0/G1期,从而阻断细胞周期进程.综上所述,肝素寡糖可能通过抑制PKC-α表达,进而抑制原癌基因的表达,阻断细胞G1/S期转换,从而抑制血管平滑肌细胞的增殖.
关键词： 肝素寡糖 蛋白激酶C-alpha 血管平滑肌细胞 增殖 -
过氧化氢降解肝素制备肝素寡糖的工艺研究
以收率为考核指标,采用正交试验筛选出过氧化氢降解肝素制备相对分子量为1.2～2kD的肝素寡糖的佳工艺条件.结果表明,优化条件为55℃、pH 7.0时一次性加入过氧化氢使其浓度达12%.
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肝素寡糖抑制血管内皮细胞生长的机制研究
动脉粥样硬化(AS)是一种常见的血管疾病,被认为是脑梗死常见的原因之一.以前的观点认为,AS是机体脂质代谢障碍的结果,但随着深入的研究,目前大多数学者认为AS是血管炎症性损伤的一种表现行为,认为其是内皮细胞功能发生紊乱后的炎症反应并在此基础上形成的一种损伤-修复过程.肝素作为抗凝血和抗血栓药物已被广泛应用.研究发现其还具有降血脂、抗炎、抗过敏抗肿瘤等多种生物学功能.而肝素寡糖被认为是由低分子肝素通过酶法、化学方法等降解得到的低分子肝素,然后再通过分离纯化得到.本实验考察肝素寡糖对内皮细胞增殖的影响及可能的机制.采用MTT法检测肝素寡糖对血清、血管内皮生长因子(VEGF)诱导的人脐静脉内皮细胞(HUVEC)增殖的影响;采用流式细胞仪检测肝素寡糖对HUVEC凋亡的影响;采用Western blot法检测肝素寡糖对HUVEC内VEGF表达的影响.结果显示在血清、血管内皮生长因子诱导下,肝素寡糖对HUVEC的增殖有抑制作用,肝素寡糖可以诱导其凋亡,并且可降低细胞内VEGF的表达.以上结果为研究肝素寡糖抑制HUVEC增殖的可能分子机制奠定一定的理论基础.
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梯度电泳制备肝素寡糖
低分子肝素是通过酶解或化学降解的方法得到分子量较小的普通肝素片断,较普通肝素抗凝血作用小,出血等不良反应发生率低,是一类很有价值的药物.本文采用聚丙烯酰胺凝胶梯度电泳对低分子质量肝素进行纯化,从凝胶中回收肝素寡糖片段,并通过高效凝胶渗透色谱法测定回收样品的相对分子质量.结果制备得到平均Mr约为3019的肝素寡糖,构建了梯度电泳制备肝素寡糖的方法.
关键词： 肝素寡糖 聚丙烯酰胺凝胶梯度电泳 制备 -
肝素寡糖的制备及其对平滑肌细胞抗增生作用的初步研究
制备肝素寡糖并初步研究其对平滑肌细胞增生的作用.采用Bio-Gel P6凝胶色谱分离纯化低分子肝素,制备不同Mr的肝素寡糖并比较其对平滑肌细胞增生的作用.结果表明,分离得到的平均Mr约3 200的肝素寡糖,具有明显抑制平滑肌细胞增生的作用,其抗Fxa效价为48.90 ant-Fxa IU/ml.
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肝素寡糖对脂多糖诱导人脐静脉内皮细胞炎症的影响及分子机制研究
以脂多糖(LPS)诱导人脐静脉内皮细胞HUVECs炎症损伤,探讨肝素寡糖对炎症的影响及其分子机制.实验分为空白组(0.5％血清培养基)、模型组(LPS +0.5％血清培养基)及给药组(LPS +0.5％血清培养基+0.01、0.1、1μmol/LHDO),采用活性氧实验检测细胞内活性氧簇水平,Western blot检测VCAM-1、p38、p-p38及核转录因子NF-κB等关键蛋白的表达水平.结果显示0.01、0.1和1μmol/L的HDO可抑制100 μg/mL LPS诱导的HUVECs炎症因子VCAM-1表达水平,较弱的影响细胞中NF-κB分布,并下调信号通路中关键蛋白p38和p-p38表达.结果表明,HDO可能通过抑制炎症信号通路中关键蛋白的表达水平来抑制炎症因子的表达,从而起到抗炎作用.
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肝素十二糖对血管平滑肌细胞增殖作用的研究
目的:研究肝素十二糖(dp12)对血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cells,VSMCs)增殖作用的影响,并分析其分子水平的作用机制.方法:通过以10%新生牛血清诱导牛胸主动脉血管平滑肌细胞增殖建立模型,然后考察实验室精制的不同浓度的肝素寡糖对血管平滑肌细胞增殖作用的影响；四甲基偶氮唑盐法( MTT)检测dp12对VSMCs增殖的影响；流式细胞仪检测细胞周期分布；RT-PCR法检测ERK1/2转录变化情况；Western Blotting法检测ERK1/2和p-ERK1/2的表达.结果:MTT结果显示不同浓度的dp12可以明显抑制由10%新生牛血清诱导的血管平滑肌细胞的增殖；细胞周期实验揭示dp12抑制血清诱导的VSMCs从G1期进入S期,影响细胞周期；dp12通过下调ERK基因的转录进而下调ERK1/2的表达,此外dp12抑制ERK1/2的磷酸化进而影响细胞增殖.结论:dp12使VSMCs在G1期/S期阻滞,通过抑制ERK基因的转录和ERK蛋白的磷酸化抑制VSMCs增殖,可能是dp12抗VSMCs增殖的机制之一.
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肝素寡糖对人外周血T细胞分泌白介素-4和白介素-5的影响
目的 研究肝素寡糖(Oligs)对人外周血T细胞(PBTLs)分泌白介素-4(IL-4)和白介索-5(IL-5)的抑制作用.方法 用3种方法 降解肝素并用凝胶过滤色谱法制备肝素寡糖.抽取10例过敏性嗜酸粒细胞性胃肠炎患者的PBTLs用植物凝集素(PHA)和Oligs处理,用ELISA法测定PBTLs培养的上清液分泌IL-4和IL-5的含量.结果 Oligs样品浓度5 μg/mL时,可显著抑制PBTLs对细胞因子IL-4,IL-5的分泌.但是,不同相对分子质量(Mr)的Oligs对IL-4和IL-5具有不同的作用.对IL-4抑制作用强的是用过氧化氢降解肝索所得Mr为1 142的四糖.抑制IL-5作用强的是用β-消除法降解肝素所得Mr为1 806的六糖.结论 Oligs对人PBTLs分泌IL-4和IL-5的抑制作用与分子结构密切相关,并且有一个基本结构.对IL-4和IL-5抑制作用强的分别是四糖和六糖.
