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基于报告基因的雌激素受体β亚型激动剂细胞筛选模型的建立
目的 建立基于报告基因和雌激素受体β(estrogen receptor β,ERβ)亚型信号通路的药物筛选模型,以期发现ERβ亚型激动剂.方法 构建带有雌激素应答序列(estrogen responsive element,ERE)靶序列和报告基因的诱导性表达载体pTAL-ERE-SEAP,并将其转入人胚肾(HEK293)细胞中,筛选报告基因分泌型碱性磷酸酶(secreted alkaline phosphatase,SEAP)表达受雌二醇(17β-estradiol,E2)诱导的阳性克隆.选取相关核受体配体进行模型的特异性考察,同时考察模型的稳定性及时效量效关系,以及免疫细胞化学染色鉴定转染后ERβ的表达情况.利用此模型对本实验室样品库中的2 622个化合物进行筛选.结果 转染pTAL-ERE-SEAP的HEK293细胞中,SEAP报告基因的表达受E2的诱导并呈剂量与时间依赖关系,E2对阳性克隆细胞无增殖作用,本模型的Z'因子值为0.7,免疫细胞化学染色结果表明,转染后ERβ表达、地塞米松以及其他配体的诱导表达率低.结论 利用此模型通过测定SEAP报告基因的诱导表达水平可筛选ERβ亚型激动剂.
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分子生物学中报告基因的主要类型及应用现状
报告基因技术在分子生物学领域中已经广泛应用于基因表达调控、启动子活性分析、信号转导、受体功能鉴定以及基因治疗、药物筛选等领域,而且随着技术和检测方法的进步,不断有新的更加灵敏和非损伤性的报告基因出现,尤其是一些不影响细胞繁殖、能够实时检测的荧光报告基因的发展更为迅速.该文从报告基因的使用现状出发,对其主要的种类、特征、应用及发展趋势进行论述.
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报告基因研究及其应用进展
报告基因是现代分子生物学研究领域中用于分析结构基因旁侧区域潜在的顺式元件(如启动子、增强子和沉默子等)和反式作用因子相互作用关系的一种重要工具,通过它的表达产物便捷、可靠、灵敏地解析基因时空表达调控的内在规律.报告基因技术广泛应用于基因表达调控、信号转导、转基因、启动子分析、受体功能鉴定、基因治疗以及药物筛选等领域,该文将对报告基因的主要类型、特点及其应用研究进展进行综述.
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GC盒不是人胰岛素基因启动子中关键顺式作用元件
目的 鉴定人胰岛素基因启动子中的GC盒(-348～-338)是否是启动子中的关键顺式作用元件.方法 用PCR克隆人胰岛素基因启动子,构建由人胰岛素基因启动子驱动的分泌型碱性磷酸酶(SEAP)报告质粒,并对报告质粒中人胰岛素基因启动子中的GC盒进行删除和突变.将报告质粒转染到β细胞系βTC3中,测定细胞培养液上清中SEAP的活性强度,进而判定GC盒与人胰岛素基因启动子转录活性的关系.结果 删除和突变人胰岛素启动子中的GC盒不能显著改变胰岛素基因启动子在β细胞中的转录活性.结论 人胰岛素基因启动子中GC盒不是一个关键顺式作用元件.
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建立基于报告基因的检测方法检测化合物G-CSF样活性
目的建立快速、灵敏、高效的基于报告基因的检测方法,基因水平检测化合物G-CSF样活性.方法将STAT3特异结合序列插入转录启始位点上游,选择氯霉素乙酰转移酶基因(CAT)和分泌型碱性磷酸酶(SEAP)作为报告基因,构建重组质粒,并将质粒转染入表达G-CSF受体的NFS-60细胞,通过检测报告基因的表达,检测化合物G-CSF样活性.结果 CAT的表达受rhG-CSF诱导并呈现剂量依赖关系,EC50等于0.044 nmol·L-1,而无关药物rhEPO不能诱导CAT表达.结论报告基因CATT的表达活性能够被其特异性配体强诱导表达,在96孔板上用ELISA法测定CAT基因的诱导表达水平,可检测G-CSF样活性的化合物.
关键词： 氯霉素乙酰转移酶基因 分泌型碱性磷酸酶 报告基因 G-CSF
