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那西肽脂质体的制备及其体外抗乙肝病毒的研究
目的制备那西肽脂质体并了解其体外抗乙肝病毒作用.方法以超声法和脱氧胆酸钠法制备那西肽脂质体,同时考察其包封率和粒径大小的影响因素.以HPLC测定那西肽含量,以透射电镜观察其形态,以激光散射法测定其粒径大小,以HepG2 2.2.15细胞模型检测那西肽脂质体对乙肝病毒HBsAg和HBeAg的抑制率.结果采用氯仿-甲醇混合液(2:1,v/v)作溶剂的那西肽脂质体包封率高于二氧六环作溶剂的.随着那西肽与卵磷脂的重量比增大,脂质体包封率呈下降趋势.脱氧胆酸钠法中的脱氧胆酸钠可以调节脂质体粒径的大小,它与卵磷脂的重量比越大脂质体的粒径越小.添加保护剂的脂质体在-20℃放置2年后基本稳定.脂质体中那西肽质量浓度为1.25,2.5和5.0μg·mL-1时,对HBsAg和HBeAg的抑制率分别达到(46.9 ±2.6)%,(55.4±1.2)%,(65±3)%和(15.1±2.3)%,(36.2±1.7)%,(36.8±2.5)%.结论超声法或脱氧胆酸钠法可以制备那西肽脂质体;那西肽脂质体对乙肝病毒HBsAg和HBeAg抑制效果优于游离那西肽.
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透明颤菌血红蛋白基因(vgb)在那西肽产生菌-活跃链霉菌中的表达
目的 将透明颤菌血红蛋白基因(vgb)整合到那西肽产生菌-活跃链霉菌(Streptomyces actuosus)的染色体上进行表达,从而提高菌体对溶解氧的利用,提高那西肽的发酵产量.方法 采用分子生物学方法构建了携带vgb的重组质粒pZV02,采用接合转移的方法将其导入那西肽产生菌-活跃链霉菌中,采用抗生素抗性标记筛选法获得了基因重组菌株.结果 在低溶氧的发酵条件下,重组菌株的那西肽产量显著高于对照菌株.结论 vgb在活跃链霉菌中的表达,可以改善菌体对溶解氧的利用,在低溶氧的条件下可以提高发酵产物那西肽的产量.
关键词： 活跃链霉菌 那西肽 透明颤菌血红蛋白基因 -
非核糖体含硫多肽类抗生素生物合成基因的研究进展
1 前言非核糖体含硫多肽类(non-ribosomal thiopeptide)抗生素是多肽类抗生素中的一个重要家族,包括硫链菌丝肽(Thiostrepton)、那西肽(Nosihepted)、短杆菌肽 S(Gramicidin S)和环孢霉素(Cyclosporine)等.
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介导含硫多肽类抗生素耐药的23S rRNA甲基转移酶NHR的生化功能
目的 研究23S rRNA甲基转移酶-硫链丝菌肽抗药性RNA甲基转移酶(thiostrepton-resistance-RNA methyltransferase,TSR)和23S rRNA甲基转移酶-那西肽抗药性RNA甲基转移酶(nosiheptide-resistance-RNA methyltransferase,NHR)的生化功能,探讨细菌对含硫多肽类抗生素产生耐药性的分子机制.方法 构建克隆,体外表达并纯化TSR和NHR蛋白;利用T7聚合酶体外转录系统体外转录生成23S rRNA底物片段;构建RNA甲基转移酶活性的体外检测体系,在14C-SAM存在的情况下,利用液体闪烁计数仪测定相应底物RNA被甲基化的程度;通过Gel shift方法观察RNA底物与TSR或NHR蛋白的体外相互结合作用.结果 得到体外表达的纯化TSR、NHR蛋白及RNA底物;TSR蛋白和NHR蛋白均能将RNA底物甲基化,且NHR甲基转移酶的活性更强;TSR和NHR蛋白与RNA底物均有结合,结合强度均随蛋白浓度增加而增强.结论 TSR和NHR蛋白都能将23S rRNA的特异位点1067A甲基化,并能诱导细菌的抗生素耐药性.
关键词： 抗生素耐药性 23S rRNA甲基转移酶 硫链丝菌肽 那西肽 -
1株海洋来源Streptomyces sp.SCSIO1682中那西肽(nosiheptide)的分离鉴定及其生物合成基因簇分析
目的 对1株海洋来源的菌株SCSIO1682进行16S rDNA分子生物学鉴定,对发酵产物中的抑菌活性化合物进行分离鉴定,并对抑菌活性化合物的生物合成基因簇进行分析.方法 通过构建基于16S rDNA序列的系统发育树来进行菌株鉴定;通过有机溶剂萃取、正相和反相硅胶层析等化学分离手段对菌株SCSIO1682的次级代谢产物进行活性追踪分离纯化;运用HR-ESI-MS,1 H和13 C NMR等波谱手段对所得化合物进行结构解析;通过对菌株SCSIO1682进行全基因组扫描测序鉴定所得化合物的生物合成基因簇.结果 该菌株被鉴定为链霉菌,命名为Streptomyces sp.SCSIO 1682,所得抑菌活性化合物为那西肽(nosihetide),鉴定了那西肽的生物合成基因簇并进行生物信息学分析.结论 从海洋链霉菌Streptomyces sp.SCSIO 1682中分离鉴定了那西肽,那西肽生物合成基因簇的鉴定为利用组合生物合成和合成生物学技术对那西肽进行结构改造提供了新的基因资源.
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含硫多肽类抗生素那西肽的研究进展
那西肽(nosiheptide)是一类由活跃链霉菌(Streptomyces actuosus)产生的新型环保含硫多肽类抗生素.本文就其结构与理化特性,生物学功能及作用机制,生产,提取工艺,测定方法,安全性及应用等方面进行了综述,对产那西肽的结构基因,菌种改良方面的研究进行了总结,对那西肽后续的研究进行了展望.
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原生质体诱变及融合选育那西肽高产菌株
目的 提高工业发酵那西肽生产水平,获得那西肽高产菌株.方法 利用溶菌酶剥离菌体细胞壁制备原生质体,通过等离子(ARTP)诱变与双亲灭活原生质体融合技术选育那西肽高产菌株.结果 通过对原生质体制备参数甘氨酸浓度,溶菌酶浓度以及酶解时间优化,确定了甘氨酸适浓度0.6％,溶菌酶适浓度50mg/mL,酶解时间70min.通过ARTP诱变筛选出突变株AH-12产量提高18％.亲本佳紫外灭活时间为4min,佳热灭活条件为65℃水浴50min.对融合子进行摇瓶选育,得到了GSM-4,GSM-5两株效价提高15％以上菌株.结论 利用原生质体诱变及融合方法可获得那西肽高产菌株.
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表面活性剂对活跃链霉菌产那西肽发酵的影响
目的 研究Triton X-1 00、CaCl2、DMSO、山梨醇、SDS、Tween-80、CTAB等表面活性剂对活跃链霉菌发酵产那西肽的影响.方法 采用单因素实验研究活跃链霉菌的基础代谢以及表面活性剂加入时间对那西肽效价的影响:采用响应面法对表面活性剂添加浓度进行优化.结果 基础代谢研究表明,活跃链霉菌产那西肽合成相对滞后于菌体生长.多种表面活性剂均显著影响那西肽的生物合成,整体表现为低浓度促进、高浓度抑制.表面活性剂依其类型及加入时机的不同,对那茜肽产量的影响表现出组间类型差异性及组内时间依赖性.结论 DMSO、CaCl2、Triton X-100在低浓度范围内对那西肽产量的促进效果为显著;分别在24、24和48h以DMSO 0.808mg/mL、CaCl20.799mg/mL和Triton X-100 0.574mg/mL的浓度为佳添加浓度,该条件下那西肽效价达到931.493μg/mL,比优化前提高了7.73％.
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24孔板培养活跃链霉菌合成那西肽条件的优化
目的 优化24孔板培养活跃链霉菌XW产那西肽的发酵条件.方法 采用单因素实验和响应面法对24孔板的发酵条件进行优化.结果 得到活跃链霉菌XW 24孔板发酵产那西肽的优发酵条件为:种子培养基装液量2.55 mL,发酵培养基装液量0.93mL,发酵时间121h.结论 通过对发酵条件的优化,可以明显提高24孔板发酵产那西肽的效价达到882.25μgg/mL,实验值与模型预测值较接近,吻合度较高,较初始效价675.63μg/mL提高了30.58％.研究结果表明24孔板发酵与摇瓶发酵之间有良好的相关性,相关系数R为0.883.
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活跃链霉菌合成那西肽的pH分段控制策略
目的 以pH分段控制策略提升活跃链霉菌产那西肽的发酵效价.方法 基于对活跃链霉菌合成那西肽基础代谢过程中的生物量、那西肽效价、糖、氨基氮以及pH值进行动态分析,以不同的单一pH值对发酵过程进行恒定控制,考察活跃链霉菌的生物量、比生长速率和那西肽合成的动态变化规律,来确定pH分段控制策略.结果 活跃链霉菌合成那西肽代谢过程中pH呈S形波动变化,菌体生长与那西肽合成的相对pH值有所不同.发酵过程恒定控制pH6.5模式下,活跃链霉菌具有大的比生长速率,恒定控制pH7.5模式下那西肽合成效价高.以C6H12O6/NH3·H2O补料方式进行pH分段控制,那西肽的合成能力比采用酸碱补料及生理酸碱性物质补料的控制模式强,发酵单位高.结论 以C6H 12O6/NH3·H2O模式进行补料,在0～72h时恒定控制pH6.5,此后恒定控制pH7.5,那西肽效价较未控制模式下提高了25.58％.
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响应面法优化那西肽发酵条件
目的 优化活跃链霉菌NXT-NA10摇瓶发酵生产那西肽的发酵条件.方法 首先用Plackett-Burman设计法筛选出影响发酵的显著因素,再用响应面法分析优化显著影响因素参数.结果 Plackett-Burman设计法筛选出4个显著影响因素为酵母粉、黄豆粉、NaCl和接种量,响应面法优化出它们的佳数值分别为酵母粉0.31％、黄豆粉6.42％、NaCl 0.41％、接种量5.5％.结论 在此优化条件下,摇瓶效价达到(1121.28±26) μg/mL,比优化前提高了10.95％.
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活跃链霉菌合成那西肽的固体斜面培养条件优化
目的 探索活跃链霉菌36#摇瓶发酵合成那西肽的固体斜面培养条件的佳工艺.方法 利用单因素与正交试验对固体斜面培养条件进行优化.结果 得到合成那西肽的活跃链霉菌36#的固体斜面优培养条件为:初始pH为7.8,培养温度为37℃,培养时间为3d,冷藏时间为0～3周,那西肽产量可达936mg/L.与原工艺相比较,那西肽的产量增加了13.8％.结论 通过活跃链霉菌固体斜面培养条件的优化,可以提高活跃链霉菌摇瓶发酵合成那西肽的产量.
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紫外诱变和氨基酸抗性筛选选育那西肽高产菌株
目的 筛选出那西肽高产菌株.方法 以活跃链霉菌CB040517作为出发菌株,通过紫外-氧化锂诱变处理,并结合前体复合氨基酸抗性筛选,选育那西肽高产菌.结果 通过致死率和正突变率的考察,确定紫外佳诱变剂量为100s.在分离培养基上层加入氯化锂和底层加入复合氨基酸进行正突变株的定向筛选,选育得到那西肽高产菌株UV-19-A12,其摇瓶效价达904.00μg/mL,比出发菌株提高72.5%,经过五代斜面传代试验考察,该菌株遗传性状稳定.结论 紫外诱变和氨基酸抗性筛选可以获得那西肽高产菌株.
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那西肽对肉仔鸡生长性能及胴体品质的影响
本试验选用120羽1日龄健康Avian肉仔鸡,随机分成3个处理,每个处理4个重复,每个重复10羽,分别饲喂基础日粮(对照组),基础日粮+5mg/kg黄霉素(黄霉素组),基础日粮+2.5 mg/kg那西肽(那西肽组),以探讨那西肽对肉仔鸡生长性能和删体品质的影响.结果 表明:(1)黄霉素组、那西肽组日增重比对照组分别提高了2.04%(P＜0.05)、6.18%(P＜0.05),料重比分别降低了7.73%(P＜0.05)、10.82%(P＜0.05).(2)那西肽组比对照组的屠宰率提高了3.22%(P＜0.05),全净膛率提高了4.19%(P＜0.05),半净膛率提高了3.67%(P＜0.05),胸肌率提高了5.68%(P＞0.05),腿肌率提高了3.71%(P＞0.05),腹脂率降低了18.40%(P＜0.05).黄霉素组与对照组胴体各项指标之间差异不显著(P＞0.05).试验结果表明,饲料中添加那西肽可以明显促进肉仔鸡的生长,改善肉仔鸡的胴体品质,而且那西肽的效果显著优于黄霉素.
