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基于类器官3D培养的何首乌易感物质肝毒性评价
采用液滴重叠法构建类器官3D培养模型,评价何首乌易感物质顺式二苯乙烯苷(cis-SG)的肝损伤作用.结果表明,相对于普通2D培养肝细胞模型,所构建的类器官3D培养模型的L02细胞和HepG2细胞白蛋白表达分别提高2.5和6.7倍;在第21天时,尿素生成水平分别提高8.3和15.5倍,且HepG2细胞构建的类器官模型显著优于L02细胞;相对于2D培养肝细胞模型,HepG2细胞构建的类器官模型的药物Ⅰ相和Ⅱ相代谢酶表达量显著上调,如CYP2C9、CYP3A4和CYP2D6表达上调分别为381.9、87.0和312.6倍,药物转运体相关基因也明显上调,提示所建立的类器官3D培养模型的肝脏合成和代谢功能显著优于普通2D培养肝细胞模型.肝毒性评价结果表明,相对于普通2D培养肝细胞模型,类器官3D培养模型可以更灵敏地评价对乙酰氨基酚等肝毒性阳性药物的毒性差异,且在类器官3D培养模型上重复给药评价的半数抑制浓度(IC50)值显著低于单次给药方式;何首乌易感物质cis-SG在普通2D培养肝细胞模型未检测到IC50,在类器官3D培养模型上单次给药方式的IC50是肝毒性阳性药环孢霉素的1.9倍,而其光学异构体反式二苯乙烯苷(trans-SG)的IC50比cis-SG高4.1倍,与前期整体动物水平的毒性强弱基本一致;cis-SG在类器官3D培养模型上多次给药方式的IC50进一步降低,提示长期用药可能增大何首乌肝损伤风险.综上,何首乌易感物质cis-SG对类器官的肝毒性大于trans-SG;类器官3D培养模型可长期培养且保留更多的肝脏合成和代谢功能,适用于中药成分低浓度、长时间暴露产生肝毒性评价和机制研究.
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基于类器官3D培养和高内涵成像的药物肝毒性评价模型研究
本研究采用HepaRG细胞建立类器官(organoids) 3D培养模型,并结合高内涵成像技术建立药物肝毒性体外评价方法.通过氢化可的松和二甲基亚砜(DMSO)诱导,使HepaRG细胞分化为明显的肝细胞形态和胆管样结构,并诱导药物代谢酶、药物转运体、核受体及肝细胞特异标志性分子白蛋白(ALB)等相关基因的表达,形成稳定的模拟肝脏功能的类器官体外评价模型;采用高内涵成像技术,通过荧光染料进行特异性、多靶点染色,从类器官球体表型、活/死细胞数量、线粒体膜电位(MMP)和细胞内活性氧(ROS)评价药物肝毒性.结果表明,采用HepaRG细胞建立的类器官体外评价模型可以准确地评价肝毒性阳性对照药胺碘酮(amiodarone, AMD)、环孢霉素(cyclosporin,CSp)及阴性对照药阿司匹林(aspirin,ASP)的毒性差异:其中AMD和CSP均浓度依赖地导致类器官球体的总细胞数和活细胞数下降,并且AMD浓度超过50 μmol·L-1时,还导致类器官球体中死细胞数急剧增多,而ASP对类器官无明显损伤作用;AMD和CSP均浓度依赖地导致MMP下降和ROS水平增高,且AMD的作用强度大于CSP,而ASP对类器官无明显损伤作用.综上,HepaRG细胞建立的类器官高内涵成像评价方法可用于药物肝毒性的体外评价,并且具有多靶标高通量、结果直观且可定量等优势.
