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恶性疟原虫Pfs25蛋白在毕赤酵母中高效分泌表达策略的研究
目的:探索Pfs25蛋白在毕赤酵母中高效分泌表达策略,提高Pfs25蛋白的表达量.方法:本研究主要通过4个方面深入研究Pfs25蛋白的高效表达策略.①构建Pfs25蛋白的诱导型表达重组株pPICZαA-Pfs25/GS115和组成型表达重组株pGAPZα A-Pfs25/GS 115,并比较两酵母菌株的表达量差异.②从培养基、pH值、表达时间等方面入手,分别对诱导型和组成型分泌表达条件进行研究,寻找适合Pfs25蛋白表达的佳条件.③利用pAO815表达载体构建Pfs25多拷贝重组酵母菌株pAO815-(α-Pfs25) n/GS115,通过提高pfs25基因拷贝数来提高表达量.④将毕赤酵母中蛋白二硫键异构酶(PDI)基因引入Pfs25重组酵母中,以提高Pfs25蛋白的分泌表达.结果:本研究成功构建了Pfs25诱导型和组成型表达重组酵母菌株,实现了Pfs25的诱导型和组成型表达,组成型表达量略高于诱导型.并通过对各种表达条件的比较研究,找到了适合Pfs25蛋白在毕赤酵母中高效分泌表达的条件.结论:通过对Pfs25蛋白高效表达策略的研究,显著提高了Pfs25蛋白在毕赤酵母中的分泌表达水平,使其表达量提高了约5倍.
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恶性疟原虫Pfs25基因在毕赤酵母中三拷贝串联分泌表达
目的:Pfs25蛋白是传播阻断型疟疾疫苗重要的候选抗原,然而,I期临床研究显示该蛋白在人体内只能激发较弱的免疫应答,如何提高Pfs25蛋白质的免疫原性成为研究重点.已有的研究表明:体外通过化学偶联方法获得的Pfs25蛋白聚合物,能显著提高其免疫原性.方法:本文从基因水平,利用同尾酶的特性构建串联的Pf25基因三拷贝融合基因(Pfs25)3,每个单拷贝基因由连接臂(linker)连接,以保证每个单体Pfs25蛋白的活性不受影响.构建重组质粒(Pfs25) 3/pPICZ仅A[或(Pfs25)3/pGAPZaA]电转毕赤酵母菌,获得酵母重组体.在三角瓶规模表达重组菌并初步纯化了目的蛋白(Pfs25)3.结果:ELISA和SDS-PAGE检测表达上清,显示有弱阳性表达.获得了纯度为83％的纯品蛋白.结论:在毕赤酵母中实现了Pfs25基因的三拷贝串联表达,为恶性疟疾疫苗的研发奠定了基础.
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Pfs25蛋白单克隆抗体的制备及双抗体夹心ELISA的建立
目的:制备恶性疟原虫子孢子囊表面膜蛋白Pfs25的单克隆抗体( mAb),建立检测Pfs25蛋白的双抗体夹心ELISA方法.方法:纯化毕赤酵母表达的重组Pfs25蛋白,并免疫BALB/c小鼠,采用骨髓瘤细胞Sp2/0与免疫BALB/c鼠脾细胞杂交的细胞融合技术,通过间接ELISA检测获得分泌抗Pfs25抗体的阳性杂交瘤细胞株,通过免疫F1鼠诱生腹水,纯化腹水,并进行mAb的各项生物学鉴定.辣根过氧化物酶(HRP)标记纯化后的抗体,以4B7为包被抗体,1B4为酶标抗体,建立了双抗体夹心ELISA法.结果:获得3株抗Pfs25的杂交瘤细胞株,其中2株有良好的稳定性和特异性.并建立了双抗体夹心ELISA检测法,检测有效范围在0.07～1 mg/mL,其检测灵敏度为41.6 ng/mL.结论:成功制备抗Pfs25蛋白的单克隆抗体,并建立了一种可用于Pfs25蛋白检测的双抗体夹心ELISA法,为Pfs25蛋白制备传播阻断型疟疾疫苗奠定了基础.
关键词： Pfs25蛋白 单克隆抗体 双抗体夹心ELISA 传播阻断型疟疾疫苗
