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呼吸道合胞病毒重组蛋白DsbA-G1F/M2的制备方法及免疫原性研究
目的 建立呼吸道合胞病毒(RSV)重组蛋白DsbA-G1F/M2的制备方法,并研究其免疫原性.方法 PCR扩增G1和F/M2基因片段,经酶切后插入原核表达载体pET-DsbA中,构建重组质粒pET-DsbA-G1F/M2,转化大肠杆菌(Escherichia coli)BL21(DE3),IPTG诱导表达,采用Ni+螯合亲和色谱法纯化尿素变性的包涵体溶液,梯度透析复性,Western-blot鉴定重组蛋白的RSV特异性,免疫BALA/c小鼠,用ELISA测定抗体滴度,MTT法测定细胞毒性T细胞活性(CTL).结果 构建的重组质粒在E.coli中表达了RSV特异性的重组蛋白,经变性、纯化并复性后获得了高纯度的DsbA-G1F/M2(＞90%);该蛋白诱导了高滴度的RSV特异性抗体和CTL活性.结论 建立了重组蛋白DsbA-G1F/M2的制备方法,该蛋白具有良好的免疫原性,为进一步研究开发RSV重组亚单位疫苗奠定了基础.
关键词： 呼吸道合胞病毒 重组蛋白DsbA-G1F/M2 原核表达 纯化 免疫原性 -
RSV CTL表位与G蛋白片段的融合表达对G蛋白片段诱导的免疫应答的调节作用
目的:观察呼吸道合胞病毒(RSV)的CTL表位F/M2与G蛋白抗原活性片段G1融合表达后,对G1诱导的免疫应答的调节作用.方法:将重组表达质粒pET-DsbA-G1和pET-DsbA-G1F/M2分别转化E.coli BL21(DE3),诱导表达融合蛋白DsbA-G1和DsbA-G1F/M2,亲和层析纯化.取上述蛋白,腹腔注射免疫BALB/c小鼠,定期采集血清和脾细胞,用MTT法测定CTL杀伤活性,ELISA测定IgG及其亚类IgG1和IgG2a抗体滴度,空斑抑制实验检测血清中和抗体.结果:经表达和纯化获得了纯度达90%以上的融合蛋白;DsbA-G1F/M2诱导了显著的RSV特异性CTL杀伤活性,而无CTL表位的DsbA-G1则不能诱导产生CTL反应;DsbA-G1F/M2和DsbA-G1均刺激产生了强烈的IgG抗体应答,但DsbA-G1所产生的IgG亚类仅为IgG1,而DsbA-G1F/M2同时诱导了高滴度的IgG1和IgG2a,显著下调了IgG1与IgG2a的比例;二者均诱导了高滴度的中和抗体,但与DsbA-G1相比,DsbA-G1F/M2所诱导的中和抗体滴度有所减弱.结论:CTL表位F/M2与G蛋白片段G1的融合表达产物DsbA-G1 F/M2,能够同时诱导细胞免疫和体液免疫应答,CTL的激活下调了IgG1与IgG2a的比例,使得免疫应答更平衡,有利于改善该候选疫苗的安全性.
