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细胞色素C注射剂质量评价及研究
目的 对细胞色素C注射剂进行标准检验及探索性研究,从而对该品种的质量及标准现状做出总体评价及分析.方法 标准检验依据《中国药典》2010年版二部,探索性研究采用肽图分析鉴别种属来源,3,3',5,5'-四甲基联苯胺(TMB)底物生色法测定活力,高效液相色谱法检测有关物质.结果 按照法定标准检验,44批细胞色素C注射液合格率100％,6批注射用细胞色素C合格率50％.结论 通过法定标准检验及探索性研究,发现该品种在质量标准及产品质量上均存在一定的问题.作为生物提取类高风险生化药品种,建议对该品种进行标准提高.
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HPLC分析胸腺法新的肽图
目的 用HPLC分析胸腺法新的肽图.方法 用TPCK-胰蛋白酶裂解和Rp-HPLC法测定胸腺法新的肽图,用ESI-LC/MS技术分析肽段的精确相对分子量.结果 根据肽段的色谱保留时间,相对分子质量归属肽图中肽段所在的色谱峰.结论 所用方法精密度高、重复性好,可为胸腺法新的质量分析和控制提供依据.
关键词： 胸腺法新 肽图分析 胰蛋白酶裂解-反相高效液相色谱法 液质联用 相对分子量 -
PEG化重组人促红素质量控制方法和标准研究
目的:建立PEG化重组人促红素质量控制方法和质量标准.方法:用正常小鼠网织红细胞计数法测定体内生物学活性,使用iCE毛细管等电聚焦电泳分析异构体,用离子色谱确定N-糖链指纹图谱,反相HPLC进行Lys -C蛋白内切酶酶切的肽图分析以及纯度测定.其余检测项目按2010年版中国药典三部方法进行.结果:建立的方法经过比较和对PEG化重组人促红素的检测,结果稳定可靠,重复性好,各指标符合《人用重组DNA制品质量控制技术指导原则》和2010年版中国药典三部的要求.结论:本研究建立了一套完善的PEG化重组人促红素质量控制体系.
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抗人TNF-α单克隆抗体液质联用肽图分析方法的建立及验证
目的:建立液相色谱-质谱联用肽图分析方法,用于抗人肿瘤坏死因子α(Tumor necrosisfactor alpha,TNF-α)单抗的专属性鉴别.方法:TNF-α单抗样品经盐酸胍变性、还原,释放出的游离半胱氨酸残基进行烷化,还原剂中和过量的烷化剂.超滤置换酶切缓冲液后进行胰酶酶切并终止.色谱条件:采用WatersUPLC BEH 300 C18(2.1 mm×150 mm,1.7μm)色谱柱,以o.1％甲酸水溶液(A)-0.1％甲酸乙腈溶液(B)为流动相,梯度洗脱(5～120 min,2％B→45％B),流速为0.2 mL· min-1,检测波长为214啪;质谱条件:采用电喷雾离子源及正离子模式,数据采集范围m以为100～1 990.结果:TNF-α单抗重链及轻链的6个互补决定区(CDR)对应肽段由质谱鉴定出,HC CDP2及HC CDP3在色谱峰图中共流出;利妥昔单抗用于评估本方法的专属性,结果显示本方法专属性强,且不受基质的干扰;选定m/z1 344(M+5)的色谱峰为参考峰,根据CDR的相对保留时间考察该方法的变异程度,5次重复测定CDR相对保留时间的RSD在0.57％～1.19％之间;中间精密度考察测定的相对保留时间的RSD在0.00％～1.08％之间;胰酶酶切比例在20∶ 1～30∶1,酶切时间在17～23 h范围内变化时,相对保留时间的均较小,符合方法耐用性的要求;样品消化后在8℃储存24h以及-20储存5d的稳定性良好.结论:基于CDR相关肽段鉴别的液质联用肽图分析方法可定性鉴定出TNF-α单抗,方法学验证结果显示该方法适用于抗人TNF-α单抗的专属性鉴别,可用于其质量控制及批检验放行.
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重组人粒细胞集落刺激因子-Fc融合蛋白(rhG-CSF-Fc)的质量研究
目的:建立重组人粒细胞集落刺激因子-Fc融合蛋白的质控方法和质量标准.方法:采用NSF - 60细胞增殖法测定生物学活性；非还原SDS - PAGE电泳和RP - HPLC测定纯度；以ELISA法分别测定残留CHO细胞蛋白和蛋白A；其余检测项目按中国药典2010年版三部规定进行.结果:用建立的方法对重组人粒细胞集落刺激因子-Fc融合蛋白原液和成品进行了检定,各项指标均符合《人用重组DNA制品质量控制技术指导原则》和中国药典2010年版三部的要求.结论:建立的质控方法和质量标准具有保证产品安全有效、质量可控的特点,可用于该类产品的常规检定.
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细胞色素C肽图分析
目的:对不同种属来源的细胞色素C原料及上市细胞色素C制剂进行肽图分析,建立细胞色素C的种属鉴别方法.方法:将细胞色素C用胰蛋白酶酶解处理后,采用高效液相色谱分析,色谱柱为Grace Vydac 208TPC8(5 mm,250 mm×4.6mm),流动相A为含0.1％三氟乙酸的水溶液,流动相B为含0.1％三氟乙酸的乙腈溶液,梯度洗脱,流速0.4 mL·min-1,检测波长214 nm.结果:马心源和鸡胸肉源的细胞色素C与猪心、牛心来源的细胞色素C肽图谱差别较大,可以明显区分开来,而猪心、牛心来源的细胞色素C肽图谱基本一致;制剂肽图显示均为猪心或牛心源细胞色素C.结论:法定标准规定细胞色素C应由猪心或牛心提取,建立的肽图分析方法能够将标准规定以外的其他来源的样品鉴别出来,可以作为细胞色素C的种属鉴别方法.
