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以龈沟液中性粒细胞弹力酶高活性率作为定量检测牙周状况的指标
目的:研究人类龈沟液中性粒细胞弹力酶的动态活动方式和高活性率,从而探讨其作为一项定量检测牙周状况指标的可能性.方法:利用滤纸条法,从33例慢性牙周炎患者提取217份龈沟液样本,用中性粒细胞弹力酶的特异性底物对该酶在龈沟液中的活性进行动态定量测量,从而计算该酶高活性率(MR-EA,单位为每个牙部位mAbs*min-1),并将结果与临床牙周状况进行综合比较分析.结果:龈沟液中性粒细胞弹力酶可分为5种不同的酶活动方式(A,B,C,D,E),其相应的MR-EA存在显著差异(P＜0.01).在临床牙周状况相同的牙部位,弹力酶活动差异有显著性,各种临床部位的弹力酶活动方式高(A%+B%)/低(D%+E%)分布情况如下:健康部位0%/92%,牙龈炎部位6%/72%和牙周炎部位21%/54%.健康部位的MR-EA值≤3.0,而病变部位的MR-EA值存在明显差异,具体分布如下:75%牙龈炎部位的MR-EA≤3.0,13%＞6.0,4%＞10.0;而60%牙周炎部位的MR-EA值≤3.0,30%＞6.0,21%＞10.0.结论:MR-EA能作为定量测定龈沟液中性粒细胞弹力酶活动的适当指标,可以用来定量检测牙周状况.
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呼吸道黏蛋白5AC基因顺式调控元件特殊蛋白-1在其转录调控中的作用
目的 探讨中性粒细胞弹力酶(neutrophil elastase,NE)诱导气道黏液上皮细胞呼吸道黏蛋白(MUC)5AC产生和mRNA表达以及MUC5AC基因顺式调控元件特殊蛋白-1(specificity protein,Sp-1)在该基因转录调控中的作用.方法 2006年3月至9月,在重庆医科大学病毒性肝炎研究所采用酶联免疫吸附试验(ELISA)和反转录聚合酶链反应(RT-PCR)方法分别检测培养细胞经0,10,50,100 nmol/L NE刺激诱导5,10,30 min后上清液MUC5AC质量浓度和细胞中MUC5AC mRNA表达水平.应用定点突变技术,在重组质粒的基础上建立MUC5AC启动子区Sp-1结合位点和核转录因子(NF)-kB结合位点单独突变体,并测定NE刺激的转染细胞荧光素酶相对活性.结果 (1)10,50,100 nmol/L NE处理A549细胞30 min,相同时间点不同浓度NE组MUC5AC蛋白表达水平分别与对照组比较差异均有显著性意义(t=3.406～20.909,均P＜0.05),且呈剂量依赖的趋势(P＜0.01).(2)100 nmol/L NE处理30 min后A549细胞MUC5AC mRNA相对表达量明显高于对照组(t=10.299,P＜0.01).(3)NE可诱导含有启动子序列-324 bp的重组质粒荧光素酶相对光强度(1.430±0.042)及pGL3E-MUC5ACNF-κB-MU荧光素酶相对光强度(1.570±0.071)增加,与未经NE诱导的未突变对照组相对光强度(0.799±0.051)相比差异具有显著性意义(t=25.675,t=11.110,P均＜0.01),而NE不能诱导pGL3E-MUC5AC-Sp-1-MU荧光素酶表达增加(P＞0.05).结论 NE可诱导A549细胞MUC5AC产生及其mRNA表达;MUC5AC基因启动子顺式作用元件下游Sp-1位点在NE诱导MUC5AC基因表达机制中起重要作用.
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地塞米松在中性粒细胞弹力酶致气道黏液高分泌中的作用机制
目的 探讨糖皮质激素在中性粒细胞弹力酶(NE)引起气道黏液高分泌中的作用机制.方法 用NE刺激A549细胞,给予地塞米松处理后,以分裂原激活的蛋白激酶磷酸酶-1(MKP-1)特异性抑制剂Ro-3l-8220、糖皮质激素受体(GR)拮抗剂RU-486为干预因素.采用RT-PCR法检测黏蛋白5AC(MUC 5AC)mRNA和MKP-1 mRNA的表达,ELISA法检测细胞中MUC 5AC蛋白含量,Western blotting法检测磷酸化细胞外调节激酶(ERK)水平和MKP-1蛋白的表达.结果 NE刺激后引起MUC 5AC基因转录和蛋白表达水平明显高于未给予NE刺激的对照组,同时伴随P-ERK水平的增高;给予地塞米松处理后,上述指标的水平明显降低,同时MKP-1的蛋白及mRNA水平增高;而给予Ro-31-8220或RU-486干预后,ERK及MUC 5AC蛋白、MUC 5AC mRNA水平则增高,而MKP-1的蛋白及其mRNA水平降低.结论 NE可通过ERK信号通路引起气道黏液的高分泌,而地塞米松可阻断这一过程,这是通过上调MKP-1的水平使ERK去磷酸化失活而实现的,且MKP-1的上调呈GR依赖性.
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核转录因子-κВ在中性粒细胞弹力酶诱导肺A549细胞Elafin表达中的作用
目的探讨在中性粒细胞弹力酶(NE)诱导肺上皮细胞表达Elafin过程中核转录因子-κВ(NF-κВ)的信号传导作用.方法肺上皮细胞株A549传代培养后分3组行条件孵育,分别为正常组、加精制猪胰NE孵育的对照组以及同时加酶和NF-κВ抑制剂二硫代氨基甲酸吡咯烷(PDTC)孵育的实验组.孵育2 h后的细胞涂片行免疫荧光细胞染色法检测NF-κВ的表达,酶联免疫吸附法(ELISA)检测孵育24 h上清液的Elafin水平.结果加入NE孵育的细胞上清液中的Elafin和NF-κВ的表达强度与空白对照组比较均有显著性差异(P<0.01);同时加入NE和PDTC孵育细胞的上述指标与NE组比较也存在显著性差异(P<0.05).培养细胞NF-κВ的表达强度与上清液中的Elafin呈显著正相关(r=0.66,P<0.01).结论 NE诱导肺上皮细胞Elafin表达的作用可能是通过激活NF-κВ来传导实现的.
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细胞外信号调节激酶信号通路在中性粒细胞弹性蛋白酶介导气道黏液高分泌中的作用
气道黏液高分泌是慢性气道炎症性疾病的重要病理特征,过量分泌的黏液在气道中潴留进而加重已狭窄气道的阻塞,同时也为细菌在气道中定植提供了良好的培养基.目前已公认气道中激活多形核中性粒细胞(PMN)释放的中性粒细胞弹力酶(NE)是炎症级联反应的终效应因子,且NE是一种目前已知的强的促黏液分泌剂[1],但其引起气道黏液高分泌的具体分子机制还不甚清楚,而细胞外信号调节激酶(ERK)作为多种信号转导通路的汇总点或共同通路[2],可能与该诱导机制有关.本研究观察ERK特异性抑制剂对NE引起的气道黏液高分泌的影响,旨在探讨其信号转导机制.
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中性粒细胞弹力酶给药模式对肺组织损伤特点的影响
在支气管-肺组织的病理改变中,具有急性过程和慢性过程代表性特征且常见的病理改变为急性肺损伤和慢性支气管炎.近年来,大量研究报道中性粒细胞在上述两种病理过程中均起着重要作用[1],但缺乏对照实验.本研究基于使影响因素相对单纯化的考虑,选择中性粒细胞炎症反应的主要终效应因子--中性粒细胞弹力蛋白酶(NE)作为造模药物[2],通过给药模式的变化来观察中性粒细胞是否在支气管-肺组织急性和慢性炎性损伤中具有重要价值.
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表皮生长因子受体在中性粒细胞弹力酶诱导气道粘液高分泌中的作用
目的探讨表皮生长因子受体(EGFR)活化在中性粒细胞弹力酶(NE)引起气道粘蛋白(MUC)分泌增加信号传导中的作用.方法健康Wistar雄性大鼠40只,随机分为3组:A组为正常对照组;B组动物采用气管内一次性给予后每日雾化小剂量NE法建立慢性支气管炎模型;C组在每次NE前预先给予EGFR拮抗剂BIBX1522.上述处理2周后于第3周取实验动物肺组织,分别行阿尔辛蓝-过碘酸雪夫氏染色(AB-PAS)测定杯状细胞数目;免疫组化法检测气道MUC5AC和EGFR的表达.结果B组大鼠气道杯状细胞数和MUC5AC、EGFR的表达强度与A组、C组比较均有显著差异.结论NE可通过气道上皮EGFR的活化使杯状细胞数目增加及MUC5AC过度生成,提示EGFR在气道粘液高分泌过程中具重要的介导作用.
