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应用绿色荧光研究人抑瘤素基因在CHO细胞中的表达
目的:建立一种简易、快速检测细胞内外源性基因稳定表达的方法.方法:以携带绿色荧光蛋白的真核表达质粒pEGFP-N1为骨架,将完整的 hOSM基因ORF克隆到pEGFP-N1上游的多克隆位点,构建表达载体pOSM-EGFP-N1,脂质体介导转染中国仓鼠卵巢细胞(CHO),G418筛选,挑选阳性克隆.荧光显微镜、流式细胞术分析转染了pOSM-EGFP-N1质粒的CHO细胞纯度.RT-PCR的方法分析OSM基因水平表达.结果:成功建立稳定表达OSM的CHO细胞株(CHO-OSM-EGFP),纯度达到99.76%,且OSM基因在CHO-OSM-EGFP细胞中稳定表达.结论:构建了携带绿色荧光、表达OSM的pOSM-EGFP-N1质粒转染的CHO细胞,只通过荧光显微镜观察和FCM检测细胞绿色荧光,即可明确OSM转染成功.为表达外源性基因阳性细胞的筛选提供了简易的方法.
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抑瘤素表达产物诱导大鼠肝干细胞WB-F344体外分化
目的:抑瘤素是一种肝细胞促分化因子,能够诱导胚胎肝细胞分化为具有各种代谢功能的成熟肝脏.构建以抑瘤素为主的肝干细胞体外诱导微环境,观察其诱导大鼠肝脏来源的干细胞WB-F344体外分化.方法:实验于2002-10/2004-07在解放军军事医学科学院放射与辐射医学研究所完成.①实验材料:表达抑瘤素的CHO-OSM-EGFP细胞株由李晓利等构建.WB-F344细胞由姚鹏博士惠赠.②实验方法:将终浓度为20%稳定表达抑瘤素的中国仓鼠卵巢细胞上清中加入浓度为1 U/mL胰岛素、1×10-7mol/L地塞米松,与WB-F344细胞共培养.空白对照组中未加入诱导分化成分CHO-OSM-EGFP细胞上清、胰岛素、地塞米松.③实验评估:采用流式细胞术分析细胞周期和细胞凋亡,光学显微镜观察细胞形态,RT-PCR分析白蛋白及甲胎蛋白基因表达.结果:①诱导后的WB-F344细胞较空白对照组G2/M+S期细胞所占比例明显减低,增殖指数下降约2.8倍,G0/G1细胞所占比例明显增加.②实验组WB-F344细胞形态发生明显改变,由初的多角形变为长梭性,细胞伸出小管状伪足,核质比例下调,形态趋于成熟大鼠肝脏实质细胞.③RT-PCR结果显示,诱导后WB-F344细胞表达白蛋白,不表达甲胎蛋白.诱导前WB-F344细胞表达甲胎蛋白,不表达白蛋白.结论:在以抑瘤素为主的诱导微环境中,WB-F344细胞表现出生长抑制,形态及功能趋于成熟的大鼠肝细胞
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抑瘤素M的研究进展
抑瘤素M(OSM)初是1986年Zarling等从U937组织型淋巴瘤细胞(histiocytic lymphomacells)培养上清液中分离的一种对A375黑色素瘤细胞有生长抑制作用的因子[1].
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心肌营养素-1的研究进展
心肌营养素-1(cardiotrophin-1,CT-1)初是Pennica等[1]于1995年从小鼠胚胎干细胞的胚状体培养液中分离获得的一种新型细胞因子,其结构与细胞因子IL-6家庭成员如白血病抑制因子(1 eukamia inhibitory factor. LIF)睫状神经营养因子(ciliary neurotrophic factor. CNTF)抑瘤素M (oncostatin M. OSM)与白细胞介素-11(Interleukin-11.IL-11)具有高度同源性[2,3],属IL-6家庭成员.
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hTERT启动子调控osm基因表达在体外的抑癌作用
背景与目的:肿瘤基因治疗中基因特异表达具有重要意义,构建特异表达载体是肿瘤基因治疗的基础.本研究探讨端粒酶催化亚基( human telomerase reverse transcriptase, hTERT)启动子调控抑瘤素( oncostatin M,osm)基因在端粒酶阳性肿瘤细胞中表达的特异性,以及 osm对肿瘤细胞增殖的影响.方法:构建 phTERT- osm表达载体,瞬时转染肿瘤细胞;采用 RT- PCR法检测外源基因表达,用 MTT法检测 osm基因表达对肿瘤细胞生长的影响.结果: hTERT启动子调控 osm基因在端粒酶阳性 HepG2细胞中明显表达,而在正常人胚肺成纤维细胞( human embryonic lung fibroblast,HEL)中未见表达.osm的表达对端粒酶阳性 HepG2、HeLa、Glc和 A549细胞的增殖有明显的抑制作用,抑制率为 12 4%～ 46 0%;而对端粒酶阴性的 HEL细胞没有明显的影响.结论: hTERT启动子在端粒酶阳性肿瘤细胞中能明显激活 phTERT- osm载体表达 osm,并抑制肿瘤细胞的生长.
