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一例原发性肾性糖尿患者的临床与基因突变分析
目的 探讨1例原发性肾性糖尿 ( primary renal glucosuria, PRG) 患者的临床表现及其分子生物学基础. 方法详细收集患者的临床资料、 生化检查及影像学检查结果, 抽取外周静脉血, 提取基因组DNA, 聚合酶链反应 ( polymerase chain reaction, PCR) 扩增SLC5A2基因的14个外显子及其与内含子的交界区, 测序确定突变情况. 结果 患者临床表现、实验室检查和影像学检查符合PRG诊断. 基因突变分析显示, 患者SLC5A2基因cDNA序列的第877位腺嘌呤A突变为胸腺嘧啶G (c. 877 A>G), 造成第293位氨基酸由丝氨酸改变为半胱氨酸 (p. Ser293Cys), 该突变位于SLC5A2的第7外显子. 蛋白序列的保守性分析和突变蛋白的功能分析均表明p. Ser293Cys为致病性突变. 结论 通过SLC5A2基因突变分析,从分子遗传学方面证实患者PRG的诊断. 临床上血糖正常的患者出现尿糖阳性且无其他近端肾小管功能障碍表现的患者应该考虑到该疾病可能, 基因分析有助于确诊.
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在mRNA水平验证SGLT2基因剪切突变的新方法
目的:由于实验技术的限制,在以往SGLT2基因突变筛查过程中未能对剪切突变在mRNA水平进行验证,因此本研究拟建立一种方便的验证SGLT2基因剪切突变的方法.方法:收集家族性肾性糖尿患者临床及家系资料,55名健康献血员作为对照.聚合酶链反应(PCR)扩增SGLT2基因14个外显子及其周围内含子区和启动子区,PCR产物直接测序法筛选突变.发现可能的剪切突变后,本研究用EB病毒转染B淋巴细胞的方法建立肾性糖尿患者的永生细胞系,提取永生细胞总RNA,应用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)扩增SGLT2编码的mRNA,经PCR扩增后直接测序的方法分析和验证剪切突变,从而确证剪切突变对mRNA的影响.结果:在家族性肾性糖尿患者中.发现了2个剪切突变位点(IVS 1-16 C＞A,IVS 11+1 G＞C),通过本研究建立的验证SGLT2基因剪切突变的方法.在SGLT2基因mRNA水平验证了剪切突变对mRNA的影响(IVS 1-16 C＞A:外显子3缺失.11+1 G＞C:外显子11缺失).结论:本研究解决了SGLT2基因mRNA在外周血有核细胞中表达量少造成mRNA获取困难的问题,建立了一种方便的验证SGLT2基因剪切突变的方法,为进一步探讨FRG的分子致病机制奠定了基础.
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人胚肾细胞SGLT2基因异源表达体系的构建
目的 构建钠依赖的葡萄糖转运蛋白2(SGLT2)基因异源表达体系，为探讨突变引起SGLT2蛋白功能及表达异常的分子机制提供实验依据。方法 利用RT-PCR法从人肾组织中获得SGLT2基因，将该基因克隆到真核表达载体PEXL-GFP(绿色荧光蛋白)中，将携带有SGLT2基因的PEXL载体转染人胚肾细胞系(HEK293细胞)，获得目的蛋白的瞬时表达。应用Western印迹及激光共聚焦显微镜检测融合蛋白在HEK293细胞的表达和分布，并通过摄取实验进一步验证SGLT2蛋白的转运功能。结果 SGLT2-GFP蛋白可在HEK293细胞表达，激光共聚焦显微镜观察发现，SGLT2-GFP蛋白在细胞膜上呈点状分布，并且与细胞膜标记物(DiI)有良好的共定位，转染SGLT2-GFP质粒的HEK293细胞的转运活性较对照组(未转染及转染空质粒细胞组)强约3.5倍(P＜0.01)。结论成功构建了SGLT2真核表达载体，为探讨SGLT2基因表达、功能及SGLT2突变在家族性肾性糖尿发病的遗传机制提供了重要的依据。
