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鼻黏膜外胚层间充质干细胞诱导分化成骨细胞的实验分析
目的 探讨鼻黏膜外胚层间充质干细胞经诱导分化为成骨细胞的效果.方法 收集SD大鼠鼻黏膜,进行鼻黏膜外胚层间充质干细胞体外培养.对细胞表面标志物CD45-FITC、CD14-PE、CD105-PE、CD34-PE、CD71-PE、CD34-PE、CD44-PE进行鉴定,并对细胞进行成骨诱导.成骨诱导分化后检测细胞在不同时间的碱性磷酸酶活性变化情况,并对细胞进行茜素红染色,观察细胞诱导分化效果.结果 大鼠鼻黏膜外胚层间充质干细胞经成骨诱导分化后,碱性磷酸酶活性在诱导4d后显著增加,并在7d达到大值,之后逐渐下降.成骨诱导至21d,对大鼠鼻黏膜外胚层间充质干细胞进行茜素红染色之后可观察到结果呈现出阳性,细胞外基质中出现钙沉积以及钙结节形成.结论 在大鼠鼻黏膜中存在一定的外胚层间充质干细胞,该细胞具有分化潜能,经诱导分化可分化为成骨细胞,具有一定的临床应用前景.
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外胚层间充质源神经干细胞-纤维蛋白支架复合体移植修复大鼠脊髓损伤
目的:评价外胚层间充质来源的神经干细胞-纤维蛋白支架复合体移植治疗大鼠脊髓损伤的疗效.方法:于大鼠鼻呼吸黏膜组织获取外胚层间充质干细胞(EMSCs),并诱导为神经干细胞(NSCs).制作大鼠脊髓横断模型,将EMSCs源性神经干细胞-纤维蛋白支架复合体移植入脊髓断端(作为NSCs-纤维蛋白支架移植组;N-F组),每周对大鼠行BBB评分,12周后对脊髓标本行免疫组织化学显色,并利用免疫印迹检测脊髓横断部位神经生长相关蛋白-43(GAP43)、神经丝蛋白-200(NF200)、突触蛋白(synapsin)的表达量,并与纤维蛋白支架移植组(Fg组)、单纯手术组(SCI组)进行比较.结果:鼻呼吸黏膜EMSCs源性神经干细胞高表达巢蛋白(nestin)、CD133,在纤维蛋白胶内生长良好,并可形成神经元样突起.从术后2周开始,N-F组BBB评分每周均高于Fg组和SCI组,差异有统计学意义.免疫印迹检测显示N-F组动物脊髓标本NF200、GAP43、synapsin相对表达量均高于Fg组和SCI组.脊髓组织切片免疫组织化学显示脊髓断端N-F组可见大量阳性神经纤维呈网络状结构,并伸入断端两侧脊髓实质;Fg组有较少量纤维通过;SCI组几乎没有阳性纤维通过.结论:纤维蛋白支架对鼻呼吸黏膜EMSCs源性NSCs的生长分化具有良好的促进作用.EMSCs源NSCs对脊髓损伤后的组织学重建和功能恢复均具有明显的促进作用.
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SHH基因修饰的大鼠鼻黏膜外胚层间充质干细胞向神经样细胞的诱导分化
目的:探讨音猬因子(sonic hedgehog,SHH)基因转染对大鼠鼻黏膜外胚层间充质干细胞(ectomesen-chymal stem cell,EMSCs)分化为神经样细胞的影响.方法:利用组织贴壁法分离、培养和纯化EMSCs,SHH基因重组腺病毒转染EMSCs(SHH-EMSCs),免疫荧光染色观察转染前后EMSCs的干细胞标志蛋白巢蛋白、波形蛋白和Connexin-43,蛋白质印迹检测SHH蛋白表达.诱导分化实验分为4组:SHH-EMSCs诱导组、SHH-EMSCs正常培养组、EMSCs诱导组、EMSCs正常培养组;倒置相差显微镜观察分化过程中细胞形态变化;免疫荧光染色和蛋白质印迹检测诱导后轴突膜蛋白(GAP-43)、β-3微管蛋白(TUBB3)、胶质纤维酸性蛋白(GFAP)和髓鞘碱性蛋白(MBP)的表达.并将SHH-EMSCs悬液注入大鼠脊髓组织内,观察该细胞在脊髓内存活和分化情况.结果:免疫荧光染色结果显示,经SHH基因转染后的EMSCs巢蛋白、波形蛋白和Connexin-43阳性率达90％;蛋白质印迹结果显示,SHH蛋白表达明显升高.SHH-EMSCs诱导组培养7 d后,细胞呈现双极、多极和锥形的典型神经细胞样形态;免疫荧光染色和蛋白质印迹结果表明SHH-EMSCs诱导组GAP-43、TUBB3、MBP和Smoothen的表达水平明显高于其他3组,差异有统计学意义;GFAP在4组细胞中均为弱表达,无显著差异.SHH-EMSCs在大鼠脊髓内存活情况良好且表达TUBB3.结论:SHH基因转染的EMSCs具有更高的向神经样细胞分化效率,并可在脊髓内存活;EMSCs可望成为移植脊修复髓损伤的一种新的种子细胞.
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大鼠鼻黏膜外胚层间充质干细胞向成骨细胞和神经元的诱导分化
目的:建立鼻黏膜外胚层间充质干细胞(ectomesenchymal stem cells,ECTO-MSCs)的体外培养方法,探讨该细胞的干细胞特性(stemness)和分化潜能.方法:在观察ECTO-MSCs在大鼠鼻腔呼吸黏膜内分布特征的基础上,体外培养扩增ECTO-MSCs,并用干细胞标志蛋白巢蛋白、CD133、CD44、波形蛋白的抗体进行免疫荧光染色,鉴定该细胞的干细胞特性;分别用成骨诱导培养基(含地塞米松、维生素C和β-甘油磷酸钠)及神经诱导培养基(neurobasal 培养液中加入B27、脑源性神经生长因子、全反式维A酸、音猬因子)诱导ECTO-MSCs向成骨细胞和神经细胞定向分化;用组织化学染色和免疫荧光染色方法,评价其诱导分化效果.结果:用成骨诱导剂诱导培养后,ECTO-MSCs碱性磷酸酶活性明显增强,在细胞表面形成大量的茜素红染色阳性的钙结节;用神经诱导培养基诱导培养后,ECTO-MSCs变化为神经细胞样形态,细胞高表达神经细胞标志蛋白NF-200,细胞发出细长突起并互相连接成神经网络.结论:大鼠鼻腔呼吸黏膜内广泛存在ECTO-MSCs,该细胞具有多向分化潜能,可作为种子细胞用于自体移植修复骨和神经组织损伤.
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成人鼻黏膜间充质干细胞的体外培养和多向诱导分化
目的:观察成人鼻腔呼吸黏膜内间充质干细胞(MSCs)的分布特征,建立鼻黏膜MSCs的体外培养方法,探讨该细胞向神经细胞及成骨细胞分化的潜能.方法:将成人鼻腔呼吸黏膜制成冷冻切片,用Nestin和Vimentin抗体进行免疫荧光染色,观察MSCs在鼻黏膜内的分布特征.对鼻黏膜细胞进行体外培养、传代,扩增出MSCs,用于细胞标志蛋白Nestin,CD133,Vimentin和Sall4的抗体进行免疫荧光染色,鉴定该细胞的干细胞特性；分别用成骨诱导培养液(含地塞米松、维生素C和β-甘油磷酸钠)及神经诱导培养液(Neurobasal培养液含B27,ATRA,TSA)诱导MSCs向成骨细胞和神经细胞定向分化；用组织化学染色和免疫荧光染色方法评价其诱导分化效果.结果:Nestin和Vimentin免疫荧光染色阳性的MSCs主要存在于鼻黏膜的固有层内,通过体外培养、传代,可扩增出大量的MSCs,该细胞表达干细胞标志蛋白Nestin,CD133,Vimentin和Sall4；用成骨诱导剂诱导培养后,该细胞的碱性磷酸酶活性明显增强,茜素红染色显示细胞表面形成大量的钙结节；经神经诱导培养液诱导培养后,细胞生长出细长突起并互相连接成网,细胞高表达神经细胞标志蛋白NF-200和BM88.结论:成人鼻腔呼吸黏膜固有层内广泛存在MSCs,该细胞具有多向分化潜能,可作为种子细胞用于自体移植修复骨和神经组织损伤.
