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正清风痛宁对骨关节炎动物模型ADAMTs-4、ADAMTs-5表达的影响
目的 分析正清风痛宁对骨关节炎动物模型膝关节软骨组织聚蛋白多糖酶1(ADAMTs-4)、聚蛋白多糖酶2(ADAMTs-5)蛋白表达的影响,探讨正清风痛宁治疗骨关节炎的作用机制.方法 将32只成功建模的新西兰兔随机分为观察组和模型组,另选取16只新西兰兔作为空白组.空白组不接受干预治疗,模型组应用生理盐水灌胃,观察组应用正清风痛宁灌胃.药物干预后4周分离膝关节软组织,观察关节形态、关节液、关节软骨,同时进行HE染色和ADAMTs-4、ADAMTs-5 mRNA检测(RT-PCR法),利用统计方法分析组间数据.结果 模型组关节软骨分级和Mankin's评分高于观察组和空白组,观察组关节软骨分级和Mankin's评分高于空白组(P< 0.05).模型组ADAMTs-4和ADAMTs-5 mRNA表达显著高于观察组和空白组,观察组ADAMTs-4和ADAMTs-5 mRNA表达显著高于空白组(P < 0.05).结论 正清风痛宁可改善骨关节炎动物模型关节病变程度,可能与其抑制ADAMTs-4和ADAMTs-5表达有关.
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纤维连接蛋白瓜氨酸化后对聚蛋白多糖酶-1活性的影响
目的 通过观察聚蛋白多糖酶-1 (ADAMTS-4)与纤维连接蛋白(FN)以及瓜氨酸化的FN(cFN)的结合活性及结合后的酶解活性,探讨ADAMTS-4的活性调节机制.方法 应用肽酰基精氨酸脱亚胺酶4(PADI4)对纤维连接蛋白(FN)进行瓜氨酸化并采用蛋白印迹法进行验证；应用酶联免疫吸附法测定FN和cFN与2种不同相对分子质量的ADAMTS-4的结合活性；使用聚蛋白多糖酶活性分析试剂盒测定2种ADAMTS-4的活性和其与FN、cFN结合后酶活性的变化.统计分析采用单因素方差分析,LSD-t检验或t检验.结果 蛋白印迹法证实PADI4可以使FN瓜氨酸化为cFN; cFN与相对分子质量为93 000的ADAMTS-4的结合活性明显低于FN(分别为0.624±0.033,2.182±0.042;t=50.522,P＜0.01),而两者与缺失碳端的相对分子质量为53 000的ADAMTS-4的结合活性差异无统计学意义(分别为0.934±0.012,0.971±0.024; t=2.388,P＞0.05).相对分子质量为93 000的ADAMTS-4能够酶解聚蛋白多糖产生大量酶解产物[ARGxx肽段浓度:(0.908±0.088) nmol/L],与FN结合后降解聚蛋白多糖的能力明显下降[ARGxx肽段浓度:(0.573±0.000) nmol/L,P＜0.05],与cFN孵育后的ADAMTS-4降解聚蛋白多糖产生的ARGxx肽段浓度[(0.830±0.020) nmol/L]明显高于与FN孵育后产生的ARGxx肽段浓度[(0.573±0.000)nmol/L,P＜0.05].相对分子质量为53 000的ADAMTS-4的酶活性在与FN或cFN孵育前后酶活性无明显变化(P均＞0.05).结论 FN能结合ADAMTS-4并抑制它的活性,PADI4能将FN转化为cFN,cFN与ADAMTS-4的结合活性明显降低,从而对ADAMTS-4的活性抑制作用减弱.
关键词： 连接蛋白类 瓜氨酸 聚蛋白多糖酶1 肽酰基精氨酸脱亚胺酶4 -
慢病毒介导的多基因联合转染BMSCs注射治疗食蟹猴膝关节炎的实验研究
目的 通过慢病毒介导环氧合酶2(cyclooxygenase 2,COX-2)-siRNA、聚蛋白多糖酶1(Aggrecanase-1)-siRNA、IGF-1基因联合转染BMSCs,将其注射至食蟹猴骨关节炎(osteoarthritis,OA)模型关节腔,探讨对OA相关炎性因子及关节软骨的影响.方法 取髋关节OA患者自愿捐赠骨髓组织,分离培养BMSCs.采用基因重组技术构建COX-2-siRNA、Aggrecanase-1-siRNA和IGF-1过表达基因的慢病毒载体,以佳感染复数40转染第3代BMSCs(病毒组),以空慢病毒转染培养作为对照(空病毒组),以正常BMSCs作为正常对照组.倒置相差显微镜下观察细胞生长状态,并行细胞计数;取转染培养1周细胞,RT-PCR检测COX-2、Aggrecanase-1及IGF-1 mRNA的表达.取健康3岁食蟹猴9只,按照Hulth造模法于右膝制备OA模型后,随机分为3组(n=3).模型制备术后6周,病毒组及空病毒组右膝关节腔内分别注射对应的1 mL BMSCs(约1×107个),空白对照组注射1 mL生理盐水.以左膝作为正常对照组.注射后观察动物一般情况;1、4、6周取双膝关节液,ELISA检测前列腺素E2(prostaglandin E2,PGE2)、IL-1、Aggrecanase-1、IGF-1浓度;6周时MRI及大体观察检查膝关节软骨改变,并取材行组织学、免疫组织化学染色观察,以及RT-PCR检测COX-2、Aggrecanase-1及IGF-1 mRNA表达.结果 转染后两组细胞形态及生长曲线无明显差异.RT-RCR检测,与空病毒组、正常对照组比较,病毒组COX-2、Aggrecanase-1表达明显降低,IGF-1表达明显增加(P＜0.05).细胞注射后各组动物均存活至实验完成.注射后1、4、6周,病毒组PGE2、Aggrecanase-1、IL-1浓度明显低于空病毒组、空白对照组,但IGF-1浓度明显增高(P＜0.05);但3组以上指标浓度均显著高于正常对照组(P＜0.05).MRI检查示,与正常对照组比较,病毒组、空病毒组及空白对照组关节面均出现异常高密度影,但病毒组区域小.大体观察及组织学观察见,病毒组、空病毒组及空白对照组关节软骨符合早期OA改变,但病毒组修复程度优于空病毒组及空白对照组,根据改良Pineda评分标准的组织学评分亦较低,比较差异均有统计学意义(p＜0.05).免疫组织化学染色示,病毒组细胞质染色较空病毒组及空白对照组深,偶尔可见棕黄色颗粒,软骨细胞较多.RT-PCR检测,与空病毒和空白对照组相比,病毒组COX-2、Aggrecanase-1 mRNA表达明显降低,IGF-1 mRNA表达明显增高(P＜0.05).结论 慢病毒介导的多基因转染BMSCs可以有效抑制食蟹猴早期OA模型膝关节腔内COX-2和Aggrecanse-1的表达,增强IGF-1的表达,降低膝关节内炎性因子浓度,有效保护关节软骨.
