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炎症病理情况下阿托伐他汀对大鼠主动脉平滑肌细胞膜电位影响及其可能机制研究
目的 研究炎症病理情况下阿托伐他汀对大鼠主动脉平滑肌细胞膜电位及大电导钙敏感钾通道活性的影响.方法 通过激光共聚焦显微镜检测DIBAC4(3)标记的大鼠主动脉平滑肌细胞(ASMC)膜电位,观察+/-catalase(过氧化氢清除剂)时IL-1β与ASMCs共培养后,阿托伐他汀对膜电位的影响,探讨阿托伐他汀能否逆转IL-1β对血管平滑肌细胞膜电位的影响及其可能机制,以及在炎症情况下阿托伐他汀对BKca单通道活性的影响.结果 12 h 50 ng/ml IL-1β的处理使ASMCs细胞膜去极化,100μmol/L阿托伐他汀可以逆转IL-1β引起的ASMCs去极化；12 h 50 ng/ml IL-1β的处理抑制ASMCs细胞膜上BKca通道活性,而100 μmol/L阿托伐他汀可以逆转IL-1β对BKca通道活性的影响.结论 阿托伐他汀可以完全逆转IL-1β引起的ASMCs去极化,BKca通道是形成血管平滑肌细胞膜电位的重要原因.膜电位与心血管疾病密切相关,BKca通道可能是心血管疾病新的药物靶点,阿托伐他汀可能成为直接开放血管平滑肌细胞BKca通道新的药物.
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慢性地塞米松通过激活BK-NLRP1信号通路导致海马神经元损伤的研究
目的:研究慢性地塞米松对海马神经元损伤及NLRP-1炎症小体激活的机制.方法:乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase,LDH)试剂盒和Hoechst 33258染色检测测定海马神经元损伤的情况.Western blot检测微管相关蛋白2(microtubule-associated protein 2,MAP2)、炎症相关蛋白(NLRP-1、ASC、Caspase-1)、白细胞介素-1β(interleukin-1β,IL-1β)和大电导钙激活钾通道(large conductance calcium-activated potassium channels,BK)表达的变化.ELISA试剂盒检测细胞炎性因子IL-1β、IL-18的含量变化.Q-PCR检测NLRP-1、IL-1β、BK的mRNA表达变化.全细胞膜片钳技术记录BK通道电流变化情况.离子选择电极法检测海马神经元细胞内钾离子的浓度.结果:慢性地塞米松(5 mg·kg-1,3 d)治疗能明显促进海马神经元LDH的释放,促进神经凋亡和减少MAP2的表达;能明显增加海马神经元NLRP-1、ASC、caspase-1、IL-1β、IL-18蛋白的表达;明显增加海马神经元NLRP-1、IL-1β、BK通道mRNA的表达;地塞米松处理能明显增加BK通道的电流,随着K+外流导致细胞内[K+]i浓度降低,进而激活了NLRP-1炎症小体,BK通道抑制剂IbTx对地塞米松的上述作用具有一定的抑制作用.结论:慢性地塞米松暴露可通过BK-NLRP1信号通路激活NLRP1炎症小体导致神经炎症,促进海马神经元损伤.
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BK通道功能性复合体的研究进展
离子通道可以与其他蛋白质耦合形成稳定的大分子复合物,以确保信号转导的效率和准确性.大电导、钙离子激活的钾离子通道(BK通道)的核心是由形成孔区的α亚基组成的四聚体,它具有BK通道的基本生理功能.在不同的组织内,BKα可以与不同的辅助性亚基结合,使通道功能变得复杂多样.BK通道可以将细胞兴奋性与细胞内的钙离子信号联接在一起,在血流、泌尿、免疫、神经递质释放等许多生命过程中发挥着重要的调节作用.近年来,大量的研究工作表明,BK通道可以与钙离子通道、细胞骨架蛋白、蛋白激酶等生物大分子形成功能性复合物,这对通道功能调控和信号转导等生命活动具有重要的生理意义.本文综述了这些BK通道功能复合体的主要分类、功能特性以及生理学意义,并对其未来的研究前景进行展望.
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BK通道的生物物理特性及其门控
大电导--钙离子激活的K(+通道(BK通道)广泛地表达于各种组织与细胞中,具有重要的生理功能.这一类离子通道同时具有钾通道家族的多种生物物理特性,包括选择透过性、电压依赖性门控、配体结合(Ca2+激活)门控,以及应力敏感性.对其结构的分析,有助于更深入了解BK离子通道及其整个K+通道家族的门控机制.通过家族共性与BK通道特异性的分析,将有助于阐明BK通道的结构及其门控机制.本文结合钾离子通道家族结构与功能的相关研究,论述了BK通道分子结构、功能及其门控机制.
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Martentoxin:一种大电导钙激活钾离子通道的独有配体
大电导钙激活钾离子(BK)通道广泛分布于可兴奋细胞与非兴奋细胞中,行使着一系列重要的生理功能.以源于蝎粗毒的高亲和性毒素作为研究工具,使BK通道的药理学和结构性质正逐步被揭示.Martentoxin是一种分离提取自东亚短钳蝎(Buthus martensi Karsch)粗毒的短链多肽,由37个氨基酸残基构成.研究表明,其对BK通道的特异性远高于其它各类型的电压门控钾通道(Kv).迄今为止,由于用以探明BK通道亚型结构与功能及相关病理的特异性药物工具仍然稀缺,因此阐明martentoxin与BK通道间的相互作用模式就显得至关重要了.鉴于此原因,本综述将针对martentoxin的药理性质和其与BK通道相互作用的分子机制做进一步阐明.
关键词： BK通道 Martentoxin 钙离子敏感性 β亚基 毒素-通道相互作用 -
孕期高糖饮食对血管紧张素Ⅱ介导的成年子代大鼠肠系膜动脉的影响
目的 研究孕期母体高糖饮食对血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)介导的成年子代大鼠肠系膜小动脉的影响.方法 以孕期母鼠给予20％蔗糖水的成年子代大鼠为高糖组(HS),孕期母鼠正常饮水的成年子代大鼠为对照组(C)；分离制备成年子代大鼠离体肠系膜小动脉,检测其对AngⅡ的反应,以及环磷酰胺(CTX)对AngⅡ介导的离体血管反应的影响；同步检测成年子代大鼠离体肠系膜小动脉中,AngⅡ介导的血管张力反应(血管直径变化)与血管细胞内游离Ca2+浓度的变化；以Western-blot方法检测成年子代大鼠肠系膜小动脉组织中BKα通道蛋白的表达.结果 与对照组相比,高糖组中AngⅡ介导的肠系膜小动脉的收缩效应显著增强(P ＜0.01)；CTX可明显降低由AngⅡ介导的高糖组肠系膜小动脉的收缩增强效应(P＜0.05)；高糖组中由AngⅡ介导的细胞内游离Ca2+浓度显著增加(P＜0.01)；高糖组肠系膜小动脉组织中BKα通道蛋白的表达显著低于对照组(P＜0.01).结论 孕期母体高糖饮食可对其成年子代大鼠AngⅡ介导的肠系膜小动脉的调控产生“印迹”效应.
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E3泛素连接酶对糖尿病冠状动脉大电导钙激活钾通道的调控及机制探讨?
糖尿病时冠状动脉平滑肌细胞上大电导钙激活钾通道(BK通道)功能异常,其表达下降受泛素-蛋白酶体系统的调控.F-box蛋白(FBXO)和肌肉特异性环指蛋白1(MuRF1)是参与调节BK-β1亚基蛋白泛素化的两种E3连接酶.FBXO和MuRF1蛋白表达增加,导致BK-β1亚基蛋白泛素化降解增加,表达减少,这可能是糖尿病时冠状动脉血管功能受损的机制之一.
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BK通道对大鼠脑缺血再灌注损伤神经细胞内钙离子浓度及凋亡的影响
目的 观察BK通道对脑缺血再灌注损伤神经细胞内钙离子浓度([Ca2+]i)和对神经元凋亡的影响。方法 将108只SD大鼠随机分为假手术组(SS组,n=36)、脑缺血再灌注组(IR组,n=36)、脑缺血再灌注且脑室内Iberiotoxin(IBTX)处理组(IBTX组,n=36),分别比较各组在不同再灌注时间后神经功能缺损评分、脑梗死面积,利用激光共聚焦显微镜技术测定各组[Ca2+]i浓度,免疫组织化学和TUNEL法分别检测BK通道表达和神经元细胞凋亡。结果 IBTX处理组在再灌注24h后神经功能缺损评分为(2.17±0.44)明显高于IR组(1.83±0.42,P＜0.05);脑梗死体积(27.97±5.84)％明显大于SS组(22.83±4.74)％(P＜0.05);激光共聚焦显微镜结果显示:IBTX处理组24h点[Ca2+]i为(914.50 ±86.57) nmol/L较SS组(732.09 ±51.30) nmol/L明显升高(P＜0.01),TUNEL细胞凋亡检测显示IBTX处理组24h神经细胞凋亡率为(15.20±6.11)％,与IR组(10.49±1.91)％比较差异有统计学意义(P＜0.05),免疫组织化学结果显示缺血再灌注损伤后BK通道的表达增加,但组间比较差异无统计学意义(P＞0.05)。结论 在缺血状态下,BK通道对神经细胞具有保护作用,其机制很可能是通过降低神经细胞内钙离子浓度和减少细胞的凋亡。
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钾通道拮抗剂IBTX对大鼠低氧海马脑片的保护作用
目的探讨钾通道拮抗剂IBTX对低氧损伤的海马脑片的保护作用及其机制.方法建立海马脑片低氧模型,将脑片分为空白对照组、低氧对照组、IBTX处理组.采用苏木精-伊红染色分别观察不同条件下培养的海马脑片CA1区的病理改变,计算海马区神经元的密度.应用末端脱氧核苷酸转移酶缺口标记(TUNEL)法及免疫组化Caspase-3染色法检测海马脑片CA1区神经元凋亡数目.结果空白对照组、低氧对照组、IBTX处理组海马脑片CA1区神经元密度分别为(114.67±5.72)、(51.22±4.71)、(72.25±2.55)个/mm,三者差异具有显著性意义(P＜0.05或P＜0.01).高倍镜下低氧对照组海马脑片CA1区神经元凋亡细胞数显著高于IBTX处理组,两者差异具有显著性意义(P＜0.05).结论钾通道拮抗剂IBTX可以减轻低氧海马脑片的损伤,其作用机制可能与减少细胞凋亡有关.
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WNK4激酶通过溶酶体途径抑制BK通道表达
目的 研究WNK4激酶对BK通道的调节作用及机制.方法 将BK和WNK4野生型(WNK4-WT)或CD4(对照)质粒DNA共同转染进Cos-7细胞中,采用免疫染色-共聚焦激光显微镜、化学发光法、Western印迹法检测BK在细胞上的分布、细胞膜表面蛋白和总蛋白的表达；并使用质子泵抑制剂bafilomycin A1( Baf A1)阻断溶酶体降解检测BK蛋白表达水平的减少是否由于其蛋白降解增多所致.结果 免疫染色-共聚焦激光显微镜发现,与对照组相比,WNK4-WT组BK在细胞膜表面的分布明显减少.化学发光法检测结果显示,对照组BK的细胞膜表面蛋白表达水平为299.9±18.6,WNK4-WT组中其细胞膜表面蛋白表达水平为148.4±13.7,比对照组显著下降(P＜0.01).Western印迹结果提示,WNK4-WT组BK的总蛋白表达水平比对照组明显减少.和对照组(100％)相比,WNK4-WT显著减少BK的总蛋白水平(42.3％±15.2％,P＜0.01),而Baf A1则逆转WNK4-WT对BK蛋白的抑制作用(82.2％±12.1％,P＜0.05).结论 WNK4激酶能同时抑制BK在Cos-7细胞膜表面蛋白和总蛋白的表达水平；WNK4激酶抑制BK通道蛋白的表达是通过增加其在溶酶体内的降解所致的.
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β-淀粉样蛋白25-35片段抑制大鼠皮层神经元大电导钙激活钾通道
目的观察β-淀粉样蛋白(AβP)的25-35片段(AβP25-35)对大鼠皮层神经元大电导Ca2+激活K+通道(BK通道)活动的影响.方法将大鼠断头取脑,急性分离皮层神经元,在神经元膜上获取"内面向外β式"膜片,并通过排管给药,记录药物对单通道电流的影响.结果 (1)所记录通道的电活动特性符合BK通道的特点,表现为大电导、K+选择性、电压依赖性和Ca2+依赖性;(2)浸浴液中给予5 μmol/L的AβP25-35,引起BK通道的明显抑制:平均开放概率(Po)减少了86.91%±10.06%(n=7,P＜0.01),平均开放时间减少了54.67%±9.30%(n=7,P＜0.01);(3)AβP25-35对BK通道的抑制作用在多数膜片中是可逆的.结论 AβP25-35可快速、可逆地抑制BK通道的活动,提示BK通道是AβP在脑内的一个作用靶点,BK通道的受损可能是AβP的神经毒性作用的机制之一.
关键词： AβP25-35 inside-out膜片钳 BK通道 阿尔茨海默病 -
兔BK通道β亚基多克隆抗血清的制备
目的:用小鼠制备抗兔BK通道β亚基的抗血清.方法:采用RT-PCR扩增编码兔BK通道β亚基胞内段的基因.在大肠杆菌中表达GST-β亚基融合蛋白.以从PAGE凝胶上切下的融合蛋白免疫BALB/c小鼠制备多克隆抗血清.用ELISA和Western blot鉴定抗血清的特异性.结果:用RT-PCR扩增出约300bp的兔BK通道基因.序列分析显示,扩增的序列与已发布的新西兰大白兔骨骼肌BK通道的序列完全一致.在E.coli DH5α成功地表达Mr约为37000GST-β亚基融合蛋白.ELISA和Western blot检测证明,针对GST-β亚基融合蛋白的抗血清,不仅可特异性地识别GST-β,也可识别源于兔组织的β蛋白.抗血清的高滴度达1:128000.结论:克隆了编码兔BK通道β亚基胞内段的基因,并成功地获得可特异性识别新西兰大白兔BK通道β亚基的高滴度抗血清,为BK通道的进一步研究提供了物质基础.
