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快速分离YAC末端的方法
近年来发展的酵母人工染色体Yeast Artifical Chromosome(YAC)可以克隆长至几百kb的DNA片段.目前世界上已有一些YAC文库,可以用PCR方法或传统的原位杂交法来筛选高密度克隆膜以得到单一YAC克隆,建立染色体特定区域的YAC重叠群,为研究此区域的DNA结构与功能及克隆其基因提供基础.
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单克隆抗体生产技术的现状与前景
自从Kohler和Milstein于1975年发明杂交瘤技术以来,该技术已广泛应用于医学基础研究,临床诊断治疗及其他科学领域的研究.随着机械化工、计算机学科的发展,单克降抗体(mAb)的生产技术日益丰富.本文对体内外生产mAb的技术及其优缺点作一综述,力图展示近年来mAb技术的新动态及发展前景.
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不同条件下人乳白蛋白YAC的高效定点打靶修饰
目的:对人乳白蛋白酵母人工染色体(HLA-YAC)进行定点改造,以便进一步利用该载体作与基因表达调控相关的研究.方法:借助kar1突变使YPH925菌株与异交配型菌株交配时丧失核融合的能力,把HLA-YAC由酵母AB1380转移到his3缺陷的YPH925菌株.分别以HIS3(对YPH925菌株)和G418R(对YPH925和AB1 380两种菌株)为选择标记,用含HLA-YAC的酵母基因组为模板,PCR克隆人乳白蛋白(HLA)基因的5'和3'端非翻译区各684 bp和940 bp为同源臂,构建打靶载体,线性化的打靶载体经电转化或醋酸锂转化转入酵母内,以菌落PCR为鉴定方法,辅以测序验证.结果:HLA-YAC在目的位置完成了定点打靶修饰,G418R的筛选效率高于HIS3,醋酸锂转化方法的打靶效率稍高于电转化.结论:对YAC的成功修饰为在动物体内的表达及调控研究打下了基础.
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转基因人抗体的制备及其抗肿瘤研究进展
鼠源抗体及基因工程技术改造的各类人源化小分子抗体在肿瘤的导向治疗中虽然已显示出强大的抗肿瘤活性,但仍有许多不尽人意之处,直接限制了其临床疗效的提高.转基因人抗体制备技术的不断成熟,由仅转移较少部分人Ig发展为可转移大部分人Ig全套胚系基因,以产生高亲和力、高特异性的完全人抗体.应用该技术制备的抗体已进入肿瘤的动物实验阶段,并获得可喜的抗肿瘤效果,具有很大的发展潜力.
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Alu-PCR联合荧光原位杂交技术鉴定bcr基因相关YAC克隆
目的制备慢性髓细胞性白血病(CML)bcr基因重排的DNA探针。方法应用Alu-PCR和荧光原位杂交(FISH)技术，对3个酵母人工染色体(YAC)候选克隆进行鉴定，制备DNA探针，并经正常人外周血淋巴细胞和慢性髓细胞性白血病患者骨髓细胞筛选。结果确定了YAC 765E3为非嵌合体，定位于染色体22q11 bcr基因区域，而且可在Ph染色体阳性细胞中易位至9q34。探针特异性杂交效率达95％。结论 FISH技术是染色体、染色体畸变鉴定和染色体上特殊序列定位的重要检测方法。联合应用Alu-PCR技术特异性扩增载体YAC中人类基因组来源的DNA制备探针，为慢性髓细胞白血病的诊断和监测微小残留病提供了一个新的手段。
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一种能精确检测人间期细胞核中21号染色体拷贝数的DNA探针
目的 制备能精确检测人类间期细胞核中21号染色体拷贝数的FISH探针.方法 利用万能引物PCR法,从定位于人21q11的YAC克隆881D2分离制备DNA探针,并用于与8例正常人和5例21三体患者的外周血淋巴细胞中期相和间期核,及经细胞松弛素B(cytochalasin B)诱导的双核细胞进行FISH分析.结果 该探针具有以下特点:(1)长度集中于350～750bp;(2)其靶序列位于21号染色体长臂上且紧靠着丝粒;(3)特异性强;(4)杂交信号明亮,容易辨认;(5)对中期相及间期细胞核中21号染色体的检出率分别高达99.60%和98.40%.结论 制备的DNA探针能精确检测人类间期细胞核中21号染色体的拷贝数,且适用于细胞分裂时21号染色体分离情况的研究.
