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喂饲转bar基因耐草胺膦油菜对大鼠主要营养素吸收利用的影响
目的 研究转bar基因油菜喂饲对大鼠主要营养素(蛋白质、脂肪、粗纤维、钙)吸收利用的影响.方法 将140只健康SPF级Wistar大鼠按体重随机分为7组,即饲养对照(常规基础饲料)组和低(2.5％)、中(5％)、高剂量(10％)转基因组及低(2.5％)、中(5％)、高剂量(10％)亲本组,每组20只,雌雄各半.采用喂饲方式进行染毒,连续喂饲28d.比较各组大鼠蛋白质功效比值,蛋白质、脂肪、粗纤维、钙的表观消化率.结果 与对照组比较,转基因组和亲本组的蛋白质、脂肪、粗纤维的表观消化率虽有所改变,但无剂量-反应关系和性别一致性,转基因组与亲本对照之间比较差异无统计学意义,未见其生物学意义,转基因各组和亲本各组的蛋白质功效比值和钙的表观消化率与对照组比较差异没有统计学意义.结论 转bar基因油菜和亲本对照油菜“中双7号”的主要营养素(蛋白质、脂肪、粗纤维、钙)吸收利用率基本具有实质等同性.
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转bar基因耐草胺膦油菜对五指山小型猪的亚急性毒性研究
目的 探讨转bar基因耐草胺膦油菜对五指山小型猪的亚急性经口毒性效应,为确定人类食用安全剂量提供参考依据.方法 分别用含10％转bar基因耐草胺膦油菜籽饲料、含10％亲本对照油菜籽饲料、常规基础饲料连续喂饲五指山小型猪30 d,观察动物一般行为表现、毒性表现和死亡情况,记录生长发育指标,检测实验前、后血常规7项、血生化12项指标,测定各主要脏器湿重及其脏器系数,并进行病理组织学检查.结果 实验期间各组动物进食正常,活动自如,鼻、眼、口腔无异常分泌物,未出现生病或死亡.与对照组相比,转基因组和亲本组动物的体重、体长、体高、胸围均未见异常改变；血液学指标、血生化指标以及各主要脏器湿重及其脏器系数均未见有生物学意义的改变；大体解剖观察未见异常,各主要组织病理学检查未见明显改变.结论 用含转bar基因耐草胺膦油菜及亲本对照油菜的饲料喂饲小型猪,未见其对动物产生亚急性毒性反应.
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抗草胺膦bar基因原核表达和纯化及其免疫反应性分析
目的 实现抗草胺膦bar基因在原核表达系统中的高效表达及纯化,并分析其免疫反应性.方法 将携带bar基因的重组质粒pET28a-bar转化到大肠杆菌BL21(DE3)中诱导表达,确定佳诱导表达条件.获得的重组蛋白经镍亲和层析纯化后,免疫BALB/c小鼠,测定抗体效价,以获得的抗BAR的抗血清作为一抗进行Western blot反应,检测蛋白的免疫反应性,分析该原核表达蛋白与转bar基因油菜中蛋白的等同性.结果 利用原核表达系统成功实现了BAR重组蛋白的高效表达,其适表达条件为:0.5 mmol/L异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)、20℃和120 r/min摇床转速诱导过夜.以纯化后的目的蛋白作为抗原免疫小鼠,得到抗BAR的抗血清.以间接ELISA法测定抗血清效价达1∶102 400,将其作为一抗进行Western blot反应,结果显示该抗体与原核表达的重组蛋白及转bar基因油菜中的BAR蛋白均能特异性结合.结论 获得了高纯度的BAR重组蛋白,制备了特异性抗BAR多克隆抗体.原核表达的重组蛋白与转bar基因油菜中的BAR蛋白具有相同的免疫反应性,为进行转bar基因产品的食用安全性评价提供实验依据.
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抗草丁膦bar基因的原核表达与多克隆抗体的制备
T的抗血清.ELISA检测抗血清效价达到1:51 200,Western blot检测证实抗血清能与目的蛋白特异性结合.结论:以纯化的bar基因表达蛋白PAT作为抗原,制备了特异性较高的抗PAT抗体.
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杜氏盐藻硝酸盐还原酶基因5'上游序列驱动bar基因的表达
目的:探讨杜氏盐藻硝酸盐还原酶(NR)基因5'上游序列(Pnr)是否可以驱动外源基因在杜氏盐藻中的表达.方法:利用改进的重叠区扩增基因拼接法(SOEing),将杜氏盐藻NR基因5'上游序列(Pnr)与除草剂抗性基因bar融合.同时将NR基因3'端序列(Tnr)与克隆载体pEGM-7zf连接,构成中间载体pEGM-7zf-Tnr.后将融合片段Pnr-Tnr与中间载体连接,构建含Pnr-bar-Tnr表达盒的盐藻真核表达载体p7NBT.电击法转化杜氏盐藻,通过草丁膦培养筛选转化藻株后对其进行分析.结果:转化藻株总RNA的RT-PCR结果扩增出与bar基因序列完全一致的目的片段.结论:杜氏盐藻NR基因Pnr能够驱动外源基因bar的转录.
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抗生素及草酊磷对盐藻生长的影响
目的:研究常用抗生素和草酊磷(Phosphinothricin,PPT)对盐藻生长的影响.方法:在固体培养基中加入不同浓度的卡那霉素、青霉素、链霉素、壮观霉素、利福平和PPT,在液体培养基中加入不同浓度PPT,对盐藻进行选择培养,观察盐藻在选择试剂作用下的生长情况.结果:卡那霉素、青霉素、链霉素、壮观霉素1600 mg/L时尚不影响固体培养基中盐藻的生长;利福平400 mg/L时可完全抑制固体培养基中盐藻的生长;而PPT 3 mg/L时即可完全抑制固体和液体培养基中盐藻的生长,5 mg/L时可以杀死液体培养基中的盐藻.结论:PPT对盐藻的生长具有很强的抑制作用,在基因工程中,以抗除草剂(BAR)基因作为盐藻的选择标记基因研究盐藻的转化是合适的,草酊磷可以作为有效的选择试剂.
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候选菌落直接进行PCR筛选重组子
转基因研究的重要一环是重组体的筛选与鉴定,常用的重组体筛选是利用其抗性筛选(Amp+,Kan+,Tet+)或蓝白斑筛选.但是,许多重组体的初选既不能用抗性筛选也不能用白斑筛选,只能用PCR、电泳、酶切等方法进行,而这种筛选则需提取质粒后才能进行.通常做法是将连接的产物涂在LB平板上,然后挑取菌落进行培养,再提取其质粒进行PCR、电泳、酶切、测序等鉴定[1-2].
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膦丝菌素乙酰转移酶的表达及单克隆抗体制备
目的 表达有生物活性的膦丝菌素乙酰转移酶(PAT),制备PAT蛋白单克隆抗体(mAb).方法 通过PCR克隆bar基因编码区全长,将bar基因与原核表达载体pET28a(+)连接,构建重组质粒pET28-bar并转化大肠杆菌菌株BL21 (DE3),经IPTG诱导目的蛋白表达,利用镍离子亲和层析纯化PAT蛋白,分析PAT蛋白活性.免疫BALB/c小鼠,取免疫后的小鼠脾脏与Sp2/0细胞融合,经间接ELISA筛选分泌抗PAT蛋白抗体杂交瘤细胞.结果 在大肠杆菌中以可溶形式表达出重组PAT蛋白,纯化的重组PAT蛋白具有乙酰转移酶活性,制备了9株抗PAT蛋白mAb.结论 表达的PAT蛋白可以用于除草剂解除剂研究,制备的mAb可能用于转基因产品的检测研究.
