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突变型人PRKAG2基因的克隆及其表达载体构建
目的 构建含有定点突变的人PRKAG2基因表达载体.方法 首先应用Trizol法抽提健康人全血mRNA,通过实时聚合酶链反应(RT-PCR)克隆得到野生型人PRKAG2 cDNA;继而通过聚合酶链反应(PCR)定点突变的方法获得突变型人PRKAG2基因,命名为G100S,后应用酶切连接的方法得到重组载体pEGFP-G100S.结果 Trizol法提取人细胞mRNA,经RT-PCR合成cDNA第一条链,特异性引物PCR扩增得到PRKAG2基因片段,目的片段条带在1761 bp左右.分段克隆得到的G100S片段分别为300 bp与1500bp左右.转化Top10感受态细菌,PCR筛选阳性菌落5个克隆有3个克隆可见1800 bp左右的阳性片段,筛选得到pEGFP-G100S重组阳性克隆.测序证实重组载体pEGFP-G100S构建成功.结论 构建的含定点突变人PRKAG2基因重组载体pEGFP-G100S为进一步研究基因PRKAG2 G100S突变的功能奠定了基础.
关键词： PRKAG2基因 定点突变 pEGFP-N1载体 人 -
人酸性成纤维细胞生长因子真核表达载体的构建及鉴定
目的 构建人酸性成纤维细胞生长因子真核表达载体pEGFP-N1-haFGF.方法 PCR扩增人酸性成纤维细胞生长因子(haFGF)基因,BglⅡ和HindⅢ双酶切后克隆入真核表达载体pEGFP-N1,构建haFGF真核表达载体pEGFP-N1-haFGF,并经限制性酶谱分析和DNA测序对重组表达载体的正确性进行鉴定.结果 重组真核基因表达载体pEGFP-N1-haFGF经限制性内切酶BglⅡ和HindⅢ酶切,DNA电泳显示465 bp的haFGF目的 片段和4 700 bp的pEGFP-N1载体片段,重组载体经DNA测序显示所克隆的haFGF 基因核苷酸顺序与Genbank中记载的haFGF序列一致.结论 本实验成功构建人酸性成纤维细胞生长因子真核表达载体,为进一步研究haFGF的功能奠定基础.
关键词： 人酸性成纤维细胞生长因子 pEGFP-N1载体 真核表达载体 -
Caveolin-1基因PEGFP-N1真核表达载体的构建及表达
目的:克隆caveolin-1(CAV1)基因开放阅读框的cDNA序列,构建PEGFP-N1/CAV1的真核表达载体.方法:设计并合成带酶切位点及保护碱基的引物,RT-PCR法扩增caveolin-1基因,PEGFP-N1载体及caveolin-1基因片段进行限制性双酶切,电泳后回收切开的PEGFP-N1 及caveolin-1片段,经连接反应后构建PEGFP-N1/CAV1真核表达载体.结果:PEGFP-N1/CAV1重组质粒经PCR电泳结果显示,得到一条在555 bp的片段;重组质粒经限制性内酶切双酶切电泳结果证实,可释放一条在555 bp的片段和4.8 kbp的载体片段;重组质粒测序结果,经BLAST比对,100%符合;瞬时转染宫颈癌Hela细胞48 h荧光显微镜及实时荧光定量PCR证实重组质粒在宫颈癌Hela中得到表达.结论:成功构建了同时携带有绿色荧光蛋白及G418筛选位点的PEGFP-N1/CAV1真核表达载体复合体.
关键词： Caveolin-1 pEGFP-N1载体 真核表达载体 -
pEGFP-N1-UCH-L1重组质粒的构建
目的构建 pEGFP-N1-UCH-L1重组质粒，并进行鉴定。方法提取 Wistar 乳鼠大脑组织总 RNA，逆转录合成cDNA，经 PCR 扩增 UCH-L1基因，定向克隆至载体 pEGFP-N1，构建重组质粒，经测序进行鉴定。结果 UCH-L1基因重组质粒经测序鉴定证明构建正确。结论成功构建了 UCH-L1基因重组质粒，可用于神经细胞转染，进行后续研究。
关键词： 泛素羧基末端水解酶 L1 pEGFP-N1载体 重组质粒 -
真核表达载体pEGFP-N1-MKRN1的构建及其在Siha细胞中的表达
目的:构建真核表达载体pEGFP-NI-MKRNl并稳定转染人宫颈癌细胞系Siha细胞,检测MKRNI表达情况及对细胞增殖和凋亡的影响.方法:用RT-PCR技术从人胚肾细胞株HEK293细胞中获得MKRNl的cDNA并将其插入表达载体pEGFP-N1中;构建的重组质粒经脂质体介导转染Siha细胞;Western Blot鉴定MKRNI在Siha细胞中的稳定表达.结果:RT-PCR成功地扩增出一条约1477 bp的片段,经限制性内切酶酶切分析和DNA序列测定证实目的基因已插入重组质粒,荧光显微镜下观察到稳定转染的细胞发出较强绿色荧光,Western Blot证明人MKRN1能以融合蛋白的形式在si-ha细胞中稳定表达.结论:成功构建了真核表达载体pEGFP-N1-MKRN1,获得了稳定表达人MKRNl基因的Siha细胞克隆,为进一步研究人MKRNI的功能及其与细胞增殖及凋亡的关系提供了实验基础和重要的细胞模型.
关键词： MKRN1 pEGFP-N1载体 SIHa细胞 增殖和凋亡
