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人WAF1基因的克隆及其生物调控作用
目的克隆人WAF1基因,构建成WAF1-pcDNA3真核表达质粒,探索WAF1基因的生物调控功能.方法采用PT-PCR和DNA直接测序方法从Hela细胞中扩增人WAF1基因,通过克隆到pcDNA3真核克隆载体上,用脂质体法转染Hct-8细胞;经免疫荧光和免疫组化方法鉴定WAF1外源基因的表达活性和对Rb基因、cyclin D1基因的调控作用.结果从Hela细胞扩增的人WAF1基因克隆至真核克隆表达载体pcDNA3中,获得了人WAF1-pcDNA3重组质粒和高效表达P21WAF1/CIP1的Hct-8细胞株;证实了WAF1具有促进Rb、抑制cyclin D1蛋白表达的调控作用.结论成功地构建了人WAF1表达质粒WAF1-pcDNA3,外源基因WAF1的表达对下游基因具有生物调控效应.
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WAF1基因研究进展
WAF1(wild-type p53 activated fragment-1,WAF1)是细胞周期蛋白依赖性激酶抑制蛋白(cyclin-dependent kinase inhibitor, CDI)家族中早被发现的成员,是细胞周期调控的主要分子之一,通过作用细胞周期的G1-S检测点(checkpoint)使细胞周期停止在G1期[1,2],并诱导细胞凋亡.近年研究显示,WAF1在调控宫颈癌、乳腺癌细胞时,不引起细胞凋亡.因此称为肿瘤调控基因更为合适.这一基因的调控十分复杂,除p53基因依赖途径和非p53基因依赖途径外,可能还有其它的调控途径.WAF1在细胞周期的不同时期表达、在细胞内不同部位的表达具有各自的机理和生物效应.尤其在大肠和乳腺肿瘤分子调控中起关键作用[3].
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人WAF1基因表达质粒的构建
目的：克隆人WAF1基因，构建成WAF1-pcDNA3真核表达质粒。方法：采用逆转录聚合酶链反应从Hela细胞中扩增人WAF1基因，并克隆到pcDNA3真核克隆载体中。结果：从Hela细胞扩增的人WAF1基因克隆至真核克隆表达载体pcDNA3中，经DNA直接测序，获得了WAF1-pcDNA3重组质粒。结论：成功地构建人WAF1表达质粒WAF1-pcDNA3，为进一步研究WAF1基因表达及生物学效应奠定了基础。
