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进口饲料及肉制品中牛源性成分的PCR检测
建立了进口饲料及肉骨粉中牛源性成分的PCR检测方法.扩增对象是牛线粒体上特异性的DNA片段,扩增产物为271bp.样品的PCR产物经直接测序及限制性酶切片段分析,以进一步鉴定扩增结果.方法灵敏度实验结果显示,当肉骨粉样品中含有0.125%的牛源性成分时仍能检出.本方法简便、快速,灵敏,为防止疯牛病通过进口食品及饲料--尤其是肉骨粉途径进入我国提供了技术保障.
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慢性乙型肝炎阿德福韦酯治疗应答不佳者外周血单个核细胞HBV-P区基因突变分析
目的 研究阿德福韦酯(ADV)治疗基因C型慢性乙型肝炎(CHB)患者外周血单个核细胞(PBMCs)乙肝病毒聚合酶区(HBV-P 区)序列的基因突变.方法 14例基因C型CHB患者分为初治组(ADV初始治疗)7例,经治组(拉米夫定100 mg口服每日1次,治疗24～56个月出现YMDD变异后换用ADV治疗)7例,ADV用药时间2～59个月,剂量10 mg口服每日1次,血清HBV DNA≥1 000 copies/ml(应答不佳)者应用直接测序法检测血清及PBMCs内的HBV-P区基因突变,比较两者的异同.结果 所有患者的血清和PBMCs内HBV均成功测序,大部分患者血清和PBMCs内的HBV序列一致.1例经治者和3例初治者感染的HBV为野生株,分别有I169I+++V+、Q215H+++Q+、P237T+++突变.另10例(71.4％)检测到HBV有1个或多个耐药位点变异,主要变异位点为A181 V/T/I、N236T.有1例血清HBV基因突变(A181T+++、N236T+++)与PBMCs内的HBV基因突变(A181T+++、N236T++ +、I169I+++V+)不完全一致.结论 ADV治疗CHB应答不佳者大部分血清与PBMCs内的HBV-P区基因突变一致,耐药模式不同,可有一个或多个位点突变,主要变异位点为A181 V/T/I、N236T.
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韧带样型纤维瘤病中APC基因和β-catenin基因突变的研究
韧带样型纤维瘤病中Wnt 信号通路异常在肿瘤的发生、发展过程中起着重要作用,我们采用聚合酶链反应(PCR)-变性高效液相色谱技术(denaturing high performance liquid chromatography, DHPLC)-直接测序的方法分析韧带样型纤维瘤病中APC基因、β-catenin基因的突变,探讨肿瘤发生发展的原因和机制.
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乙型肝炎患者表面抗原与抗体检测和分析
我们采用Abbott公司的Imx自动免疫分析仪及其微粒子酶免分析法进行HB-sAg、抗-HBs、HBeAg、抗-Hbe和抗-HBc的检测；采用美国Biatronics公司建立的Am-plisensor法进行PCR定量检测；采用PCR产物直接测序。统计学方法，率采用x检验；均数采用t检验；相关性采用直线回归分析。共调查317例，男254例，女63例，年龄2～77岁，平均(32.9±14.7)岁，共检出HBsAg与抗-HBs同时阳性者29例，总检出率9.15％，其中无症状感染者4.69％(3/64)、急性肝炎0(0／16)、慢性肝炎11.11％(16／144)、重型肝炎18.42％(7／38)和肝硬化5.45％(3／55)。
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乙型肝炎病毒S基因直接测序分型方法的建立及应用
HBV血清分型并不能真正反映病毒的异质性以及病毒真正的种系关系,通过对HBV全基因组的比较,HBV分为8个基因型,分型标准依据全基因序列测定,基因型间同源性>92%或基因型间异质性≥8%,S基因序列测定,基因型间同源性>96%或基因型间异质性≥4%[1,2].本研究通过建立乙型肝炎病毒S基因直接测序分型方法,初步探讨HBV基因分型的意义.
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大肠癌细胞线粒体DNA D-环区的突变
目的:研究大肠癌细胞线粒体DNA D-环区突变情况.方法:用PCR与直接测序相结合的方法,对比分析三株大肠癌细胞系和1例原代培养的正常肠上皮细胞的线粒体DNA D-环区的突变位点.结果:三株大肠癌细胞系和1例正常的肠上皮细胞的线粒体DNA D-环区均存在不同程度的点突变,其中72位C→T,73位A→G,16298位C→T,16519位T→C这四个突变位点在三株癌细胞和正常肠上皮细胞中均检测到,考虑为多态性变化.在SW480和LOVO细胞线粒体中检测到16224位T→C、16311位T→C两个相同的突变位点,在SW480和HT29细胞线粒体中检测到114位C→T、498位C→T、16234位C→T三个相同的突变位点.结论:大肠癌细胞线粒体DNA D-环区具有多态性和突变性,特征性的突变可能与大肠癌的易感性有关.
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NEUROG3基因突变在糖尿病人群中的筛查研究
应用直接测序方法对270名无亲缘关系的对象(其中80名为正常对照组,94例为早发性糖尿病家系先证者,96例为2型糖尿病病例)进行NEUROG3基因筛查,发现2个序列变异:在5'非翻译区的-44-45delCA及S199F变异,未发现NEUROG3基因变异与本组人群早发性糖尿病,2型糖尿病的发病相关.
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蛋白S基因突变导致肺栓塞1例
目的：对1个新的遗传性蛋白S基因缺陷症家系进行基因突变检测。
方法：筛查导致患者肺栓塞的诱因，在未服用抗凝药华法林的情况下检测血浆蛋白S活性（ProteinS凝固法法国STAGO）、血浆蛋白C活性（ProteinC发色底物法法国STAGO ）、抗凝血酶Ⅲ活性（ATⅢ发色底物法法国STAGO）、血浆游离蛋白S抗原（Liatest Free PS免疫比浊法法国STAGO）作实验诊断；用PCR法对先证者蛋白S基因的15的外显子及其侧翼内含子序列进行扩增，PCR产物纯化后直接测序，作基因诊断；进行家系调查，并比对相关人员进行基因诊断；对所发现的点突变采用在正常人群中进行相应区域PCR扩增结合测序的方法进行多态性筛查。 -
G6PD缺乏症杂合子检测方法的研究进展
G6PD缺乏症是常见的遗传性酶缺乏疾病,全世界约4亿人受累,多分布在非洲、中东地区和东南亚.我国则主要分布在两广(广东、广西)地区.1967年WHO制定了根据酶活性和酶动力学鉴定G6PD酶变异型的统一方案.现已鉴定出400余种G6PD生化变异型[1].1986年国外实验室可克隆出了G6PD的cDNA并获得了cDNA顺序.1991年美籍华人Ellson发表了G6PD基因组全序列.应用克隆G6PD基因技术或PCR联合直接测序,现已鉴定出140种G6PD基因突变型[2].
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分化型甲状腺癌端粒酶逆转录酶启动子突变的临床意义
目的 探讨端粒酶逆转录酶(TERT)启动子突变与分化型甲状腺癌(DTC)临床病理特征之间的关系.方法 选取2014年10月至2016年1月间甘肃省肿瘤医院头颈外科229例经临床病理确诊为分化型甲状腺癌患者、52例结节性甲状腺肿患者和31例正常甲状腺组织.采用聚合酶链式反应(PCR)直接测序法对所有组织中TERT启动子突变进行检测.结果 DTC中,TERTC228T/C250T突变率为7.9％(18/229),其中TERT C228T位点突变率为0.9％(2/229),TERTC250T位点突变率为7.0％ (16/229),结节性甲状腺肿和正常甲状腺组织均未发生该突变.TERT启动子突变与DTC患者性别、年龄和复发危险度分层均相关,差异均有统计学意义(均P＜0.05).结论 检测TERT启动子突变可以帮助区分甲状腺肿瘤良恶性,对患者预后评估有指导意义.
关键词： 甲状腺肿瘤 端粒酶逆转录酶启动子突变 直接测序 -
人WAF1基因的克隆及其生物调控作用
目的克隆人WAF1基因,构建成WAF1-pcDNA3真核表达质粒,探索WAF1基因的生物调控功能.方法采用PT-PCR和DNA直接测序方法从Hela细胞中扩增人WAF1基因,通过克隆到pcDNA3真核克隆载体上,用脂质体法转染Hct-8细胞;经免疫荧光和免疫组化方法鉴定WAF1外源基因的表达活性和对Rb基因、cyclin D1基因的调控作用.结果从Hela细胞扩增的人WAF1基因克隆至真核克隆表达载体pcDNA3中,获得了人WAF1-pcDNA3重组质粒和高效表达P21WAF1/CIP1的Hct-8细胞株;证实了WAF1具有促进Rb、抑制cyclin D1蛋白表达的调控作用.结论成功地构建了人WAF1表达质粒WAF1-pcDNA3,外源基因WAF1的表达对下游基因具有生物调控效应.
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非小细胞肺癌PTEN 基因突变的临床特征
目的:了解非小细胞肺癌中PTEN基因突变的分布状况及其临床特征.方法:选取2003年9月至2009年12月间182例在广东省人民医院收治的非小细胞肺癌患者的手术或穿刺标本,抽提RNA后,逆转录成cDNA,再进行PCR扩增PTEN 1～9外显子及EGFR 18～21外显子,用直接测序法检测基因突变.结果:182例标本中,PTEN基因的突变率为9.9%(18/182),PTEN基因的突变率女性为6.5%,男性为11.0%(P=0.549);吸烟者为13.0%,非吸烟者为6.7%(P=0.15);腺癌为7.8%,鳞癌为9.9%(P=0.628),差别均无统计学意义.常见的突变类型有点突变、插入突变及缺失突变,共11例,主要分布在第8外显子,也可见于第4、5、9外显子;其中10例为男性吸烟者,1例为男性非吸烟者;8例为鳞癌,1例腺癌,2例大细胞癌;此外,发现7例大片段缺失突变,缺失片段位于第1～7外显子,约250～539 bp碱基丢失,突变率为3.8%(7/182),除了1例为大细胞癌外,其余6例均为腺癌;PTEN基因突变率与性别、吸烟状态分布无统计学相关性;其中4例大片段缺失伴随EGFR基因敏感突变.结论:具有不同PTEN基因突变类型的NSCLC可能是两种不同的疾病类型,不同突变类型的PTEN基因在NSCLC中的作用机制不同.PTEN基因的大片段缺失可能是突变型EGFR对TKI原发耐药的原因之一
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乙肝病毒基因变异研究概况
随着聚合酶链反应(PCR)及其扩增产物直接测序等分子生物学技术的发展和应用, 使人们从分子水平认识病毒及其变异成为可能. 机体在感染乙肝病毒(HBV)后能够产生活跃的抗病毒细胞免疫反应, 然而仍有许多HBV感染者不能清除病毒, 成为持续病毒携带者.
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非小细胞肺癌患者肿瘤组织中 EGFR、K-Ras 和 BRAF 基因突变的分子病理检测分析
目的：探讨非小细胞肺癌(NSCLC)患者肿瘤组织中 EGFR、K-Ras 和 BRAF 基因各亚型突变情况。方法应用直接测序方法检测550例 NSCLC 石蜡组织中 EGFR 基因、K-Ras 基因和 BRAF 基因突变情况。结果 NSCLC肿瘤组织中 EGFR 基因总突变率为37.09%(204/550),外显子18、19、20和21的突变率分别为1.45%(8/550)、21．09%(116/550)、3.64%(20/550)和11.09%(61/550)；EGFR 基因各外显子之间双重突变共13例(2.36%),EGFR基因各外显子内双重突变共12例(2.18%)。 K-Ras 基因总突变率为2.00%(11/550)。 BRAF 基因总突变率为0．36%(2/550)。结论 NSCLC 患者中 EGFR 基因存在较高的突变率,尤其为19和21外显子突变,其基因突变亚型分类能指导 EGFR-TKI 的肿瘤靶向治疗,K-Ras 和 BRAF 基因突变率虽低但不容忽视。
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中国河北地区汉族人群padi4-94单核苷酸多态性的研究
目的 研究中国河北地区健康汉族人群PADI4基因padi4-94 位点多态性及其分布特征,比较种族间的基因型及等位基因频率分布差异.方法 随机选取106例河北地区汉族个体,对padi4-94位点PCR产物进行直接测序.结果 中国汉族人群padi4-94位点存在三种基因型,AA、AG和GG,频率分别为22.6%、40.6%和39.8%,等位基因频率A为42.9%,G为57.1%.将日本、英国、西班牙、瑞士、北美等人群相关资料与本研究比较发现,此位点的基因型及等位基因频率差异均无统计学意义(P＞0.05).结论 中国河北汉族人群padi4-94位点存在多态性,这种多态型在种族间可能不存在差异,这将为在汉族人群中研究padi4-94相关疾病提供可靠依据.
关键词： padi4-94基因 单核苷酸多态性 直接测序 汉族人群 -
人WAF1基因表达质粒的构建
目的：克隆人WAF1基因，构建成WAF1-pcDNA3真核表达质粒。方法：采用逆转录聚合酶链反应从Hela细胞中扩增人WAF1基因，并克隆到pcDNA3真核克隆载体中。结果：从Hela细胞扩增的人WAF1基因克隆至真核克隆表达载体pcDNA3中，经DNA直接测序，获得了WAF1-pcDNA3重组质粒。结论：成功地构建人WAF1表达质粒WAF1-pcDNA3，为进一步研究WAF1基因表达及生物学效应奠定了基础。
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B抗原减弱表型的表型频率与ABO基因分析
目的：对血清学表现为B抗原减弱的血液样本进行筛查和ABO基因分析，了解其分布特征和分子遗传学基础。方法筛查并收集B抗原减弱（与抗-B血清试管法凝集强度中等）的样本，采用血型血清学方法进行鉴定分析，采用直接测序的方法对ABO基因的第6、7外显子及第6内含子进行序列分析，对可追踪家庭进行家系分析。结果从241952份样本中检出13例B抗原减弱表型，其中B型9例、AB型4例；所有样本的红细胞与抗-H反应均增强；其中2例可检出不规则抗-B；ABO基因型分别为A102/Bw12（1例）、B101/B101（2例）、B101/O02（3例）、A102/B101（3例）、B101/O01（4例）。在1例基因型为B101/O01个体的家系成员（父亲）中检出相同表型。结论该类表型在B型人群中的频率约为1∶7000；除1例样本的B等位基因存在278C＞T突变（Bw12）外，其余样本在第6、7外显子和第6内含子中均未检出突变；ABO基因酶催化活性区域编码序列以外的基因变异，可能是导致B抗原减弱的原因之一。
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9年内质粒介导喹诺酮类耐药决定子发生率
近年来,一些导致低水平喹喏酮类药物耐药的质粒介导耐药(PMQR)基因陆续被发现.本研究选取1998-2001年和2005-2006年韩国一所三级医院血标本中分离的261株大肠埃希菌、135株肺炎克雷伯菌和65株阴沟肠杆菌,采用多重PCR方法筛检qnrA、qnrB、qnrC、qnrS、aac(6′)-Ib和qepA 6个PMQR基因,并直接测序,aac(6′)-Ib阳性PCR产物使用BtsCI酶切,以明确aac(6′)-Ib-cr变异体.结果,461株中37株(8%)携带有上述6种PMQR中的1种,其中13株(5%)为大肠埃希菌,13株(10%)为肺炎克雷伯菌,11株(17%)为阴沟肠杆菌.
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NOD2基因P268S突变是中国人克罗恩病的易感基因吗?
本期龙靖华等作者发表的论文,采用聚合酶链反应(PCR)扩增NOD2/CARD15基因12对外显子,纯化后直接测序的方法,研究了我国广东地区48例克罗恩病(CD)患者、50例溃疡性结肠炎(UC)患者和50名健康对照者NOD2基因突变与炎症性肠病(IBD)的相关性,结果发现了一个有意义的现象,CD组NOD2 P268S突变率显著高于UC组和健康对照组,且与CD患者的发病年龄、病变部位和并发症呈显著相关,CD组、UC组和健康对照组均未检出3个西方人常见的R702W、G908R和L1007fsinsC基因突变,提示P268S可能是与中国人CD发病相关的等位基因,为国人CD遗传发病机制的研究提供了一条重要的线索.
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儿童散发性肾病综合征致病基因筛查策略的探讨
目的 通过儿童散发性肾病综合征(NS)致病基因及其突变特点,探讨儿童NS致病基因的筛查策略.方法 收集复旦大学附属儿科医院肾脏风湿科2011年1月1日至2013年12月31日的所有住院NS患儿的临床资料,依据发病年龄分为先天性NS(3月龄内)、婴儿型NS(～12月龄)、儿童早发型NS(～5岁)和儿童迟发型NS(～ 14岁);对儿童早发型和迟发型NS再依据对糖皮质激素(GC)治疗反应分为GC敏感(SSNS)和GC耐药(SRNS),SRNS又分为初发型和迟发型SRNS.先天性NS行NPHS1、NPHS2、PLCE1、LAMB2、LMX1B、COQ2基因所有外显子和WT1基因8、9外显子直接测序;婴儿型NS行NPHS1、NPHS2、PLCE1基因所有外显子和WT1基因8、9外显子直接测序;儿童早发型和迟发型NS行NPHS2基因所有外显子和WT1基因8、9外显子直接测序,以及NPHS1等8个基因42个常见突变位点的SnapShot分析.结果 238例NS患儿进入本文分析,男139例.①8/10例(80％)先天性NS患儿检出NPHS1基因致病性突变;②12例婴儿型NS患儿检出3例WT1(25.0％)、2例NPHS2(16.7％)和1例NPHS1(8.3％)基因突变;③8/132例(6.1％)早发型NS患儿检出基因突变,均属于初发型SRNS(8/32,25.0％),其中WT13例(9.4％)、NPHS2 2例(6.3％)、NPHS1 2例(6.3％)和INF21例(3.1％),19例迟发型SRNS和81例SSNS患儿均未检出相关基因突变;④84例儿童迟发型NS中未检出基因致病性突变.结论 先天性NS、婴儿型NS和儿童早发型NS中的初发型SRNS患儿应是临床基因筛查的对象.NPHS1是本文先天性NS患儿的主要致病基因,推荐在先天性NS患儿行NPHS1基因检测.NPHS1、NPHS2和WT1基因突变频率在婴儿型NS和儿童早发型NS中的初发型SRNS患儿中较高,推荐这些人群中优先选择这3个基因作为目标基因进行筛查.不推荐常规在SSNS和迟发型SRNS患儿中行基因检测.
关键词： 儿童 肾病综合征 致病基因 SNaPshot分析 直接测序
