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大鼠肝癌变中p53点突变及其蛋白表达的研究
目的研究大鼠肝癌变中突变型P53蛋白（mP53）的表达及p53基因第6外显子点突变。方法通过DEN诱发的启动模型和肝癌模型，应用免疫组化、MDT-PCR-SSCP和直接测序技术分别研究mP53表达和p53基因第6外显子点突变。结果 mP53阳性细胞仅见于癌前个别肝细胞增生结节中，8/18例（44.44%）肝细胞癌呈mP53阳性；8例mP53阳性肝癌中仅有1例（12.50%）被检出p53基因第6外显子发生点突变，即第208位密码子第1碱基C→G颠换。结论在DEN诱发的启动模型和肝癌模型中p53基因突变可发生于大鼠肝癌变之癌前及肝癌形成阶段，且第6外显子突变率低。
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嗜麦芽窄食单胞菌对氟喹诺酮类抗菌药的分子耐药机制研究
目的:研究嗜麦芽窄食单胞菌拓谱异构酶II和IV的突变与氟喹诺酮类药物的耐药关系,为新药开发提供实验依据.方法:选择对环丙沙星MIC>2mg/L且主动外排机制阴性的菌株,对其gyrA和parE的喹诺酮决定区域基因分别进行PCR扩增,纯化后直接测序.结果:嗜麦芽窄食单胞菌在DNA解旋酶常见的83位和87位没有突变,同时在GyrA的整个QRDRs没有氨基酸的改变,并且其83位是Gln而不是其它革兰阴性菌常见的Ser或Thr.5株菌中的parE各有1株菌在402和432突变,但是该突变与FQNS耐药不相关,未观察到Valdezate研究中的1/2菌株的parE突变频率高且主要集中在437,465,477和485位的现象.结论:嗜麦芽窄食单胞菌对FQNS耐药与主动外排泵有关,可能与外膜的通透性降低有关,但与DNA解旋酶和拓谱异构酶IV的靶位点改变关系尚不明确,需进一步研究.
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中国糖尿病人群TCF1基因突变的遗传及临床特征研究
目的 对中国早发及多发糖尿病患者进行转录因子1(transcription factor 1, TCF1,HNF-1A)基因筛查以了解中国人早发及多发糖尿病家系中TCF1基因突变发生情况及突变携带者临床特征.方法 用PCR产物直接测序的方法在341个无亲缘关系的中国人[其中80名为正常对照者,261例为早发和(或)多发糖尿病家系先证者]中对TCF1基因启动子区,整个编码区及内含子/外显子结合区进行筛查.结果 总共发现5个突变,其中4个突变位点(T82M,Q130H,G253G,P353fsdelACGGGCCTGGAGC)为新发现的突变位点,突变携带者平均体重指数为21.9 kg/m2,胰岛素分泌受损.本研究中TCF1基因突变在中国人早发性糖尿病患者中的发生率约为3%.此外,在261例先证者中还发现了11种碱基替换.其中有3种变异[IVS 1-8 (G→A), IVS 1-128(T→G) 和IVS 2+21(G→A)]在80名非糖尿病健康对照中未被观察到,其中IVS 1-8 (G→A)未见报道,且这两种在启动子处变异在家系中表现为与糖尿病共分离.结论 TCF1基因突变不是中国人早发及多发糖尿病的主要原因.
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一个中国汉族ABO血型B亚型家系中发现新的B等位基因
目的研究中国汉族人群ABO血型中B亚型的分子遗传背景,发现并鉴定ABO新等位基因.方法随机选择10个正常的B型志愿捐血者样本作对照,对6例血型血清学鉴定为B亚型的样本,采用序列特异性引物-聚合酶链反应方法、ABO基因第6及第7外显子PCR产物直接测序,进行基因定型;并对B等位基因的第6外显子、第6内含子及第7外显子进行基因克隆和单倍体测序分析. 结果 2例血清学为Bx、BW的B亚型样本中,发现一个新的B等位基因.该等位基因与B101等位基因相比,差异仅在第7外显子nt695位T>C突变.进一步对其中一个Bx血型的个体进行家系调查,结果该家系的11人中,7人带有该新B等位基因.而其余的4例B亚型样本及10例对照样本,ABO基因的第6、7外显子未发现新的点突变. 结论首次发现695T>C变异的新B等位基因,该等位基因nt695位由T转变为C,232位氨基酸由亮氨酸转变为脯氨酸,可导致糖基转移酶活性的降低,表明ABO基因的第232位氨基酸对决定糖基转移酶活性至关重要.
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中国人早发性糖尿病GCK基因突变的筛查
目的了解葡萄糖激酶(glucokinase)基因GCK突变和序列变异在中国人早发性糖尿病人群中的发生情况.方法应用直接测序方法对174名无亲缘关系中国人(其中80名为非糖尿病对照组,94例为早发性糖尿病家系先证者)进行GCK基因启动子区、10个外显子及其侧翼内含子区筛查.结果未在编码区发现突变,但发现几种先前已经报道的序列变异:外显子1a的5'非翻译区,位于翻译起始点上游84bp处GGCGG→GGGGG(糖尿病组G等位基因频率0.106比对照组0.075,P=0.355);IVS1b+12(A→T)(糖尿病组T等位基因频率0.005而在对照组未发现该变异);IVS 5+29(G→T)(糖尿病组T等位基因频率0.027比对照组0.019,P=0.731);IVS 9+8(T→C)(糖尿病组C等位基因频率0.585比对照组0.694,P=0.044).此外,还发现1个未被报道的新的序列变异IVS 9+49(G→A)(糖尿病组A等位基因频率0.011比对照组0.006,P=1.000).未发现外显子1a的5'非翻译区,-84bp处(C→G)、IVS 5+29(G→T)、IVS 9+8(T→C)和IVS 9+49(G→A)变异与血糖、胰岛素、C-肽及空腹血脂谱等临床变量相关.结论 GCK基因突变不是中国人早发性糖尿病发病的主要原因.
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4例Ax亚型血清学及分子遗传分析——发现一个新的Ax等位基因
目的 对4例正反定型不符的献血者标本进行分子遗传分析,分析其分子生物特征.方法 采用吸收放散进行红细胞弱抗原检测,SSP-PCR方法进行基因分型,采用PCR产物直接测序分析其序列.结果 该4例标本均为Ax或AxB亚型,测序结果表明,第六、七外显子含有4个碱基错义突变,分别为nt467T＞C,nt526G＞C,nt539G＞A,nt646T＞A.一个碱基无义突变nt537G＞A.其中nt526G＞C,nt539G＞A两个错义突变和nt537 G＞A无义突变是在Ax亚型个体中首次发现.结论 Ax亚型可能是多个碱基突变,引起氨基酸的改变,导致糖基转移酶活性的降低,从而使红细胞上表达的A抗原大大减少.
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福建省汉族人群Ax亚型分子遗传学分析——附1例新的α1,3-N-乙酰半乳糖胺基转移酶等位基因
目的 了解福建省汉族人群中Ax亚型的表型频率,探讨其遗传学特征.方法 用微板法对本中心2003～2009年的福建汉族献血者共424 792人(份)作血液标本筛查,对血清学表现为Ax亚型的献血者标本和50例(包括30人(份)血清学鉴定为正常A型及20人(份)B型抗-A减弱)对照标本,采用PCR扩增ABO基因第6、7外显子及第6内含子,并对扩增产物测序.结果 从424 792份献血者血样中共检出9例Ax亚型,从这些个体的A等位基因中,新发现1例存在467C＞T、721C＞T突变的Axnew等位基因,3例为已报道的Ax09、2例为A307、2例为A102以及1例A205等位基因.结论 福建省人群中Ax的表型频率估计约为0.002 1%,Ax表现型在福建省汉族人群中存在遗传异质性;发现1个新的引起Ax亚型的A等位基因.
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福州地区无偿献血人群ABO亚型分布与分子遗传学分析
目的 调查并研究福州地区无偿献血人群ABO亚型的分布特点及其血清学与分子遗传学特征.方法 采用微孔板凝集法对2007～2010年本中心无偿献血者进行ABO血型鉴定,对正反定型结果不一致或凝集强度异常的标本进行血清学分析和亚型鉴定,对判定为ABO亚型的标本采用直接测序方法进行ABO基因第6～7外显子的序列分析.结果 190 960名献血者中,有27例标本经血清学分析初步判定为ABO亚型;其中A亚型11例(A21例、Ax 6例、AxB1例、Ael 3例),B亚型15例(Bw8例、ABw 4例、B32例、AB3 1例),B(A)亚型1例.对其中26例ABO亚型标本进行了ABO基因分析,在10例标本中检出6种已报道的亚型等位基因A205(Ax 1例)、AX09(Ax2例)、A307(Ax、AxB各1例)、Ael06(Ael 1例)、Bwl2(Bw 1例)、B(A)04(B(A)1例),和2种新发现的亚型等位基因AXI9(Ax 1例)和A221(A21例),AXI9等位基因存在467C＞T和721C＞T错义突变,A221等位基因存在467C ＞T和607G＞A错义突变.另2例A亚型和14例B亚型未检出亚型基因.结论 福州地区无偿献血人群中,ABO亚型频率约为1:7 000;大多A亚型血清学表现典型、与抗-A凝集微弱、ABO基因第6、7外显子存在错义突变;相反大多B亚型与抗-B凝集强度中等,ABO基因第6、7外显子不存在错义突变.
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罕见B(A)血型的鉴定及临床安全输血的研究
目的 鉴定2例B(A)血型及临床安全输血的研究.方法 对2例血型进行血型血清学和分子生物学方法进行验证.结果 结合ABO基因直接和克隆测序相互验证,排除碱基假突变,与B101等位基因序列相比,均为nt640A＞G,其余碱基序列完全一致,但2者各有l条单倍型序列是正常的001等位基因(nt261G缺失),符合B(A)04/001的基因型.但是二者血型血清学结果略有区别.结论 B(A)血型是1种非常罕见的ABO亚型,鉴于B(A)亚型的特殊性,在临床定型和配血中,需要血站血型室工作者引起高度的重视,因此对B(A)血型进行家系调查,动员家属,同型互助输血,另外在国内建立罕见亚型档案库,对于有条件的罕见亚型者还可考虑自体冷藏及红细胞冰冻长期保存贮血,更有必要努力的方向是通过新一代高通量测序的方法更深入研究血型的基因多态性.从而建立适合我国人群特征的B(A)血型的安全输血策略,提高临床用血的安全.
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抑癌基因p53与喉鳞癌
p53基因是已知肿瘤抑癌基因和癌基因中变异频率高的基因.近年的研究表明p53基因突变在喉鳞癌的发生发展过程中可能起着重要作用.有关喉癌中p53基因突变率各家的报道相差较大,约在28%～80%不等.目前关于应用银染PCR-SSCP技术及DNA直接测序方法研究喉鳞癌新鲜组织中p53基因的文献报道较少,参考现有文献,本文将p53基因的研究新进展及其与喉癌的关系做一综述.
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两株登革2型病毒E、NS1蛋白基因序列测定及其系统发生分析
目的: 对从登革出血热(dengue hemorrhagic fever, DHF)病人血清分离到的一株登革2型病毒(dengue virus type 2, DEN-2 B株)和DEN-2 NGC株作E、NS1蛋白部分基因序列测定并进行系统发生树分析,了解其变异及分子进化特证.方法: 利用RT-PCR法扩增B株和NGC株E、NS1部分基因片段,PCR产物直接测序;利用DNAssist软件预测其氨基酸序列,以及PHYLIP软件的CLUSTAL方法绘制系统发生树.结果: B株与NGC株E蛋白基因区第1～476 nt(476 bp)碱基序列存在8个位点的差异;编码氨基酸存在4个位置的不同;NS1基因区第589～1 002 nt(413 bp)碱基序列存在7个位点的差异,编码氨基酸有2个位置的改变;B株与NGC株和DEN-2 44株E区部分片段核苷酸同源性分别为99.1%和98.7%;与NS1区部分片段核苷酸同源性分别为98.3%和98.1%.B株E基因、NS1基因序列已登录GenBank,注册号分别为AY179733和AY238471.结论: B株E、NS1基因序列和氨基酸序列与NGC株存在差异;B株与我国海南1989年流行的DEN-2 44株和NGC株系统进化关系较近.
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中国布依族人的起源及迁移初探--来自Y染色体和线粒体的线索
为探讨中国布依族人的起源及迁移,采用PCR-RFLP法观察了由13个单核苷酸多态位点(SNPs)组成的Y染色体单倍型在中国布依族人群中的分布,同时用PCR直接测序对其线粒体DNA Region V区多态进行检测,将结果与我国其他民族及世界各大洲人群进行比较.结果表明中国布依族人的单倍型分布与我国同属侗傣语系的壮族、侗族、黎族及金秀的瑶族为接近,提示布依族人与上述人群有一定的亲缘关系.并结合文史资料,对中国布依族人的起源及迁移进行了初步探讨.
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结直肠癌患者肿瘤组织中 KRAS和 BRAF基因突变的分子病理检测分析
目的：探讨结直肠癌患者肿瘤组织中KRAS和BRAF基因各亚型突变情况。方法应用直接测序方法检测263例结直肠癌石蜡组织中KRAS基因和BRAF基因突变情况。结果结直肠癌肿瘤组织中KRAS基因总突变率为31．56％（83／263），其中63例（23．95％）检测到外显子2第12密码子突变，包含 G12C 点突变3例（0．55％），G12D点突变28例（10．65％），G12V点突变23例（8．75％），G12S点突变4例（1．52％），G12A点突变3例（1．14％）和G12R点突变1例（0．38％）；其中17例（6．46％）检测到KRAS基因外显子2第13密码子突变，为G13D点突变，未检测到G13C点突变；其中3例（1．14％）检测到KRAS基因外显子3第61密码子点突变，包含Q61H点突变1例（0．38％），Q61L点突变1例（0．38％）和Q61R点突变1例（0．38％）；BRAF基因V600E点突变4例（1．52％）。结论结直肠癌患者中 KRAS基因存在较高的突变率，尤其为G12D、G12V 和 G13D ，KRAS 和BRA F基因检测能指导利妥昔单抗或帕尼单抗的靶向治疗。
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荧光素和地高辛标记探针在聚合酶链反应-微孔板杂交检测TTV DNA中应用比较
目前聚合酶链反应(PCR)扩增产物常规检测采用琼脂糖凝胶电泳法,其敏感度、特异性均不能满足临床要求.对PCR产物进行限制性内切酶酶切片段长度多态性(PCR-RFLP)分析、变性梯度凝胶电泳(PCR-DGGE或PCR-SS-CP)及PCR产物直接测序,虽可特异性检测PCR产物,但因操作繁杂,且需特殊试剂和仪器,无法在临床普遍开展.刊用特异性探针与扩增产物杂交,引用微孔板杂交酶呈色技术,由于其特异性和敏感度高而被应用于临床.我们采用荧光素和地高辛分别标记探针,建立荧光素-抗荧光素、地高辛-抗地高辛酶偶联系统微孔板杂交酶呈色技术检测TTV DNA的方法,并对其检测效果进行了比较.
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进行性对称性红斑角化症的遗传异质性
目的探讨兜甲蛋白基因(LOR)在进行性对称性红斑角化症(PSEK)发病中的作用.方法收集一个中国人PSEK家系的血样并提取基因组DNA,用直接测序法对其LOR序列进行测定,并利用10个多态性微卫星标记对包含LOR的1q21区域进行遗传连锁分析,以证实测序结果.结果测序结果显示本家系患者LOR的编码区和剪接区无致病性突变,连锁分析也排除了包含LOR的1q21区域与本病存在连锁的可能性.结论排除了LOR突变对该PSEK家系的致病作用,首次提供了本病存在遗传异质性的直接实验证据;应采用全基因组扫描技术平台对该家系进行致病基因的重新定位与确定.
关键词： 进行性对称性红斑角化症 直接测序 遗传连锁分析 遗传异质性 -
结核分枝杆菌耐异烟肼基因突变的快速检测
目的: 探讨编码过氧化氢-过氧化物酶的katG基因突变与结核分枝杆菌异烟肼(INH)耐药性的相关关系. 方法: 根据结核分枝杆菌genebank中katG序列,自行设计特异性寡聚核苷酸引物,采用聚合酶链反应-单链构象多态性(polymerase chain reaction-single strand conformation polymorphism, PCR-SSCP)分析和直接测序法(direct sequencing, DS)分析结核分枝杆菌中katG基因突变情况. 以H37 Rv标准株为对照. 结果: 所有23株敏感菌均未有SSCP结果异常; 35株耐药菌中,有2株(5.7%) katG基因扩增阴性,且发生在高度耐药菌中. 进一步分析发现,SSCP法突变检出23株(65.7%),测序法突变检出24株(68.6%),符合率为95.8%(23/24). 结论: 参照测序法对耐药菌突变序列的分析结果,PCR-SSCP敏感、特异,可快速检测结核分枝杆菌katG耐药基因突变,有利于耐药结核分枝杆菌耐药性的快速检测.
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中国汉族人群中Dia抗原和Dib抗原的分子遗传分析
目的 研究中国汉族人群Diego血型系统中Dia和Dib抗原表达的分子遗传背景.方法 采用血型血清学方法对2990例非血缘关系的捐血者进行Diego血型鉴定,从中随机选择20例表现型为Di(a-b+)的样本,以及筛选到的所有Di(a+b-)稀有血型样本,采用PCR-SSP、DNA直接测序方法分析Diego血型基因的分子遗传背景.结果 2990例捐血者中,发现Di(a+b-)表现型2例,Di(a+b+)167例,Di(a-b+)2821例.随机选择的20例表现型为Di(a-b+)的DNA样本,经PCR-SSP法检测的基因型为DI2DI2,对DI基因第19外显子直接测序,2561位上碱基为C.2例稀有血型Di(a+b-)的DNA序列在19外显子2561位上碱基为T,基因型为DI1DI1.结论 中国汉族人群Dia和Dib抗原表达的分子遗传基础是DI基因第19外显子2561位上碱基T-C的置换,引起第854位氨基酸的改变.
