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iASPP真核表达载体的构建及其对NIH3T3细胞增殖的影响
目的:构建iASPP真核表达载体,稳定转染小鼠成纤维细胞(NIH3T3)并检测其表达,观察其对NIH3T3细胞增殖的影响.方法:设计引物以源克隆PCMV-iASPP为模板PCR扩增其中的CDS区,亚克隆入FLAG-pcDNA3.0,将该重组质粒转化DH5α感受态大肠埃希菌,筛选阳性克隆,经酶切、测序鉴定后,用脂质体介导转染NIH3T3细胞,G418加压筛选28 d,RT-PCR、Western blotting检测基因、蛋白表达;MTT法观察细胞增殖能力.结果:重组质粒鉴定正确,筛选所得阳性克隆中可以检测到iASPP基因的转录和表达,且该iASPP阳性表达细胞株增殖能力明显增强.结论:成功构建iASPP真核表达载体并成功构建稳定表达iASPP的NIH3T3细胞株,证明该基因的稳定表达在体外能显著增强NIH3T3细胞增殖能力.
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转基因小鼠模型的载体构建和在人肝癌HepG2细胞中的表达
目的:构建转基因小鼠模型的载体并检测在人肝癌HepG2中的表达效果.方法:将n-3多不饱和脂肪酸脱氢酶基因fat-1插入到真核表达载体(pcDNA3.1(+)myc-HisA)中,构建重组表达载体pcDNA3.1(+)myc-His A-fat-1,用脂质体介导的方法转染到人肝癌HepG2细胞中,RT-PCR检测fat-l基因的表达,MTT法分析fat-l基因对HepG2细胞增殖的影响,气相色谱分析检测fat-l基因对HepG2细胞n-6/n-3多聚不饱和脂肪酸(PUFAs)比例的影响.结果:成功地构建了真核表达裁体peDNA3.1(+)myc-HisA-fat-1,并能在HepG2细胞内有效异源表达.48h后可检测到fat-l mRMA的条带.与对照细胞相比,fat-l基因有效地抑制了人肝癌细胞HepG2细胞的增殖(70%,p＜0.01),降低了n-6/n-3 PUFAs比例.结论:pcDNA3.1(+)myc-His A-fat-l重组载体构建成功并能在肝癌细胞中有效的表达,可以作为下一步转基因小鼠的合适载体.
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小鼠OX40原核表达载体的构建及表达
目的 构建小鼠OX40胞外段基因的原核表达载体并进行诱导表达.方法 PCR扩增OX40胞外段基因并将其插入原核表达质粒pET32a(+),重组pET32a-OX40经测序鉴定后转入表达菌株B121(DE3)进行融合蛋白的小量诱导表达.结果 出现新增蛋白条带,融合蛋白主要存在于包涵体中;Western Blotting分析表明该融合蛋白可与相应抗体发生特异性结合.结论 构建了小鼠OX40基因的原核表达载体,获得OX40胞外段融合蛋白.
