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大鼠脑出血后细胞凋亡与Caspase-3、Ref-1表达的相关性
[目的]研究脑出血(intracerebral hemorrhage,ICH)血肿周围缺血半暗带区中半胱氨酸蛋白酶(Caspase-3)与氧化还原因子-1(redox factor-1,Ref-1)的表达与细胞凋亡的关系.[方法]采取立体定向技术,将SD大鼠自体不凝血50 μl注入大脑尾状核区制备脑出血模型,将大鼠随机分为正常组和出血组,分别在不同时间点断头取脑,连续切片作TUNEL、Ref-1和Caspase-3免疫组化染色.[结果]脑出血后血肿周围缺血半暗带区中细胞凋亡与Caspase-3表达呈正相关(r=0.466,P＜0.01),与Ref-1表达呈负相关(r=-0.195,P＜0.05);且Caspase-3表达在开始及高峰时间上先于细胞凋亡的发生,Ref-1表达明显下降和下降谷底时间均早于细胞凋亡出现的时间.[结论]缺血半暗带区脑组织中细胞凋亡与Ref-1及Caspase-3表达相关,且caspase-3表达的高峰、Ref-1表达的下降均先于细胞凋亡的发生.
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黄芪总黄酮和黄芪甲苷对H2 O2诱导的MRC-5细胞氧化损伤的保护作用
目的：探讨黄芪总黄酮（AF）和黄芪甲苷（Astr）对硫氧还蛋白（Trx）和无嘌呤/无嘧啶核酸内切酶/氧化还原因子-1（APE/Ref-1）的表达影响及作用机制。方法将培养的细胞随机分为对照组、H2 O2组、AF＋H2 O2组和 Astr＋H2 O2组。 H2 O2作用于MRC-5细胞建立细胞氧化损伤模型；MTT法观察细胞活力，免疫荧光检测8-OHdG的表达，确定MRC-5细胞氧化损伤情况；流式细胞仪测定细胞凋亡；RT-PCR和Western印迹法检测APE/Ref-1、Trx mRNA和蛋白的表达。结果800μmol/L H2 O2孵育细胞24 h可显著诱导MRC-5细胞损伤，使细胞存活力下降至47.25％，细胞经AF和Astr与H2 O2共孵育后，明显抑制由H2 O2引起的 APE/Ref-1蛋白表达下调，上调 Trx的表达，降低了8-OHdG 含量，抑制了氧化环境下的MRC-5细胞凋亡，细胞存活率明显升高。结论 Astr和 AF通过上调 APE/Ref-1和 Trx的基因表达水平、拮抗H2 O2而对 MRC-5的氧化损伤具有保护作用。两者相比Astr优于AF。
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APE/Ref-1在消化系统肿瘤中的研究进展
DNA碱基切除修复(BER)参与由各种原因导致的DNA损伤修复过程,是维持基因组DNA完整性的一个重要修复机制.脱嘌呤/脱嘧啶核酸内切酶/氧化还原因子-1(APE/Ref-1)是BER过程的关键酶之一,具有DNA修复、氧化还原激活、基因表达调控等多种生物学功能,近年研究显示APE/Ref-1与胃癌、结直肠癌、胰腺癌的发生关系密切.本文就APE/Ref-1在消化系统肿瘤中的研究进展作一综述.
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脑出血患者血肿周围组织氧化还原因子-1表达与细胞凋亡的关系
目的:研究脑出血患者血肿周围组织氧化还原因子-1(Ref-1)表达与细胞凋亡的关系.方法:根据发病到手术的时间,将30例脑出血患者分为＜6 h组(6例)、6～12 h组(7例)、12～24 h组(5例)、24～72 h组(6例)和≥72 h组(6例).应用HE染色、免疫组化染色和逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)分别观察血肿旁约1 cm处脑组织的病理学、Ref-1、凋亡细胞、促凋亡基因Bax和抑凋亡基因Bcl-x的变化情况.选择在发病12 h内手术的7例脑出血患者作为对照组,观察手术入路上远离血肿处少许脑组织的上述指标,并与血肿周围组织进行比较.结果:HE染色显示,对照组和＜6 h组的血肿周围组织基本正常,6～12 h组损伤较轻,12～24 h组损伤较重,24～48 h组损伤严重,以后逐渐好转,8 d时与对照组相似;免疫组化染色显示,凋亡细胞和Bax蛋白表达在发病6 h后逐渐增高,12～72 h达高峰(P＜0.01),以后逐渐下降.Bcl-x蛋白表达在发病后12～72 h虽有升高趋势,但无统计学意义(P＞0.05);RT-PCR显示,Ref-1 mRNA表达在发病后12～72 h期间明显下降(P＜0.01),此后逐渐上调.Bax和Bcl-x mRNA表达与免疫组化染色结果相似.相关分析显示,Ref-1 mRNA表达与凋亡细胞和Bax蛋白及mRNA表达呈显著负相关(P＜0.01),与Bcl-x蛋白及mRNA表达无相关性.结论:Ref-1 mRNA表达可能对脑出血后血肿周围组织细胞凋亡的产生和细胞的保护起重要作用.
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大鼠脑出血后氧化还原因子-1表达与细胞凋亡相关性的研究
目的 探讨脑出血(ICH)后血肿周围组织中氧化还原因子-1(Ref-1)表达与细胞凋亡的关系.方法 应用立体定向技术,将SD大鼠自体不凝血50 μl注入其尾状核区制备ICH模型,分别在不同时间点断头取脑,连续切片作Ref-1免疫组化染色和原位末端标记(TUNEL)染色;观察各时间点Ref-1表达及TUNEL阳性细胞数,并进行相关性分析.结果 ICH后血肿周围组织中TUNEL阳性细胞与Ref-1表达呈负相关(r= -0.745, P＜0.05),且Ref-1表达下降谷底时间明显早于细胞凋亡高峰的时间.结论 ICH后血肿周围组织中细胞凋亡增加与Ref-1表达减少可能有关.
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纳洛酮干预对大鼠脑出血后血肿周围神经细胞中氧化还原因子-1表达与凋亡的影响
目的:观察盐酸纳洛酮对脑出血后血肿周围神经细胞中氧化还原因子-1 (redox factor-1 Ref-1)表达的影响.方法:应用立体定向技术,将SD大鼠自体不凝血 50 μl 注入其尾状核区制备脑出血模型,将动物随机分为正常对照组,假手术组、出血组和纳洛酮干预组,并分别在不同时间点断头取脑,连续切片作Ref-1和TUNEL (terminal deoxynucleotidyl transferase [TdT]-mediated deoxyuridine triphosphate [dUTP]-biotin nick end labeling)免疫组化染色.结果:经盐酸纳洛酮干预后,血肿周围神经细胞中Ref-1表达与脑出血相对应组比较,在 12 h 影响不明显,48 h 能增加Ref-1表达(P＜0.01);72 h 亦能增加Ref-1表达(P<0.05);盐酸纳洛酮干预性治疗后,血肿周围神经细胞中TUNEL阳性细胞数与脑出血相对应组比较,在 12 h 明显影响,48 h 能明显减少凋亡(P<0.05);72 h 更明显(P＜0.01).结论:盐酸纳洛酮能通过提高ICH缺血半暗带区Ref-1表达等途径,增加修复氧化损伤的DNA能力,减少细胞凋亡,有脑细胞保护作用.
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RNA干扰Ref-1表达对肝癌顺铂敏感性的影响
目的 建立表达氧化还原因子-1(Ref-1)小分子干扰RNA的重组逆转录病毒载体pmscv/siRef-1,观察人肝癌细胞株HepG2下调内源性Ref-1后对顺铂的敏感性变化.方法 采用基因重组技术构建逆转录病毒载体pmscv/siRef-1.包装逆转录病毒,感染HepG2.RT-PCR及Western blot法检测感染后细胞内Ref-1 mRNA 和蛋白表达,MTT法检测HepG2细胞下调Ref-1表达后对顺铂的敏感性变化.结果 pmscv/siRef-1能有效被包装并感染靶细胞,感染pmscv/siRef-1病毒的HepG2细胞Ref-1蛋白与mRNA表达量明显降低,细胞对顺铂敏感性显著增加(P＜0.05).结论 成功构建以逆转录病毒为基础的抑制内源性Ref-1表达的RNA 干扰载体;RNA干扰Ref-1基因可显著提高HepG2细胞对顺铂的敏感性.
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新生大鼠缺氧缺血性脑损伤氧化还原因子-1蛋白表达及意义的研究
目的探讨新生大鼠缺氧缺血性脑损伤(HIBD)后,氧化还原因子-1(APE/Ref-1)蛋白在大脑皮质不同时相的表达及其与神经细胞凋亡的关系.方法将新生7日龄SD大鼠制成HIBD动物模型,采用免疫组织化学方法及原位缺口末端标记(TUNEL)法分别观察正常对照组、假手术组及缺氧缺血1,3,6,12,24,48 h APE/Ref-1蛋白及神经细胞凋亡变化.结果APE/Ref-1蛋白在正常对照组、假手术组神经细胞核内广泛表达,两组间差异无显著性(P>0.05);而缺氧缺血组大脑皮质该蛋白表达随缺血时间的延长而下降,且各时间点间差异显著(P<0.05).大脑皮质凋亡阳性细胞表达与APE/Ref-1相反,其随缺血时间的延长逐渐增多,并在24 h达到高峰,均高于正常对照组及假手术组(P<0.05).结论新生大鼠脑组织缺氧缺血后,大脑皮质神经元APE/Ref-1蛋白表达减少,凋亡细胞表达增加,提示APE/Ref-1蛋白减少和DNA修复功能失败可能与脑缺氧缺血后神经细胞的凋亡发生有关.
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以Ref-1为靶点的基因治疗在大肠癌5-FU化疗增敏中的作用及机制研究
目的：探讨以Ref‐1为靶点的基因治疗在大肠癌5‐氟尿嘧啶（5‐FU ）化疗增敏中的作用及其可能机制。方法构建Ad5／F35‐Ref‐1小干扰RNA（siRNA）重组腺病毒（siRef‐1）敲低Ref‐1蛋白表达，MTT法检测不同剂量5‐FU作用LOVO细胞存活率的改变；TUNEL法检测LOVO细胞凋亡；Western blot检测Ref‐1蛋白表达；EMSA测定核转录因子κB（NF‐κB）的DNA结合活性。结果感染siRef‐1腺病毒较感染对照腺病毒的LOVO细胞对5‐FU的敏感性明显增强，半数抑制浓度（IC50）分别为1．69、7．04μmol／L ；且siRef‐1显著增加5‐FU诱导的细胞凋亡。5‐FU呈剂量依赖性诱导LOVO细胞Ref‐1蛋白表达，同时伴有NF‐κB活性增强。siRef‐1抑制5‐FU诱导的LOVO细胞Ref‐1蛋白表达以及NF‐κB激活。结论以Ref‐1为靶点的治疗显著增强大肠癌细胞5‐FU化疗敏感性，其机制可能主要是通过抑制大肠癌细胞N F‐κB活性和碱基切除修复功能。
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APE/Ref1在H2O2诱导耳蜗螺旋神经节细胞氧化损伤过程中的表达
目的 研究氧化还原因子-1(apurinic/apyrimidimic endonuclase/redox factor 1, APE/Ref-1)在过氧化氢(H2O2 )诱导耳蜗螺旋神经节细胞(spiral ganglion cells, SGCs)氧化损伤过程中的表达.方法 原代培养离体大鼠SGCs,采用免疫荧光和Western blot方法检测APE/Ref-1在H2O2诱导SGCs 氧化损伤过程中的表达.台盼蓝染色法计算SGCs氧化损伤过程中的死亡率. 结果 APE/Ref-1在体外正常培养SGCs细胞质和细胞核均有表达,细胞核较强.H2O2浓度≥60 μmol/L 时, SGCs死亡率显著升高,APE/Ref-1在细胞核表达明显减弱,与对照组相比差异具有统计学意义(P＜ 0.05). 结论 APE/Ref-1在氧化环境下SGCs细胞核表达减少,细胞死亡率升高,提示氧化环境下细胞活性降低可能与APE/Ref-1表达减少有关.
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APE/Ref-1基因重组腺病毒的构建表达和鉴定
目的 构建表达氧化还原因子-1(APE/Ref-1)基因的复制缺陷型重组腺病毒,为进一步研究APE/Ref-1在耳蜗螺旋神经节氧化损伤病理过程中的作用机制提供实验基础.方法 应用RT-PCR 技术从大鼠脑组织总RNA克隆出APE/Ref-1 基因, 将APE/Ref-1 基因定向克隆到穿梭质粒pAdTrack-CMV上,经与腺病毒骨架质粒pAdEasy-1 在大肠埃希菌BJ5183内同源重组后,转染293 细胞进行包装,并反复感染293细胞进行扩增.对其进行安全性、滴度以及活性等检测.采用Western blot 对APE/Ref-1蛋白表达进行检测和鉴定.结果 克隆出大鼠APE/Ref-1基因,经测序证实结果正确;得到高滴度的重组腺病毒,提取病毒DNA证实含目的基因.结论 成功构建了表达APE/Ref-1 的复制缺陷型重组腺病毒.为进一步研究APE/Ref-1在耳蜗螺旋神经节的氧化损伤过程中作用机制奠定了实验基础.
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免疫组化法检测大肠肿瘤DNA修复基因APE1表达和细胞定位
目的 探讨DNA修复基因脱嘌呤/脱嘧啶核酸内切酶(apurinic/apyrimidinic endonuclease 1,APE1)在大肠癌发生、发展中的作用.方法 应用免疫组化PowerVisionTM法检测125例大肠癌、72例大肠腺瘤、60例癌旁大肠黏膜和40例正常大肠黏膜中APE1的表达和细胞定位,并分析其与大肠癌临床病理之间的关系.结果 正常大肠黏膜APE1呈胞核表达,大肠腺瘤和大肠癌组织APE 1表达特征发生改变,呈胞核表达、单纯胞浆表达或核浆共同表达,大肠癌组织APE1胞浆异位表达率为73.6%,大肠腺瘤APE1胞浆异位表达率为83.3%,二者差异无统计学意义(P＞0.05),但均显著高于癌旁大肠黏膜(10%)和正常大肠黏膜(0) (P＜0.01).APE1胞浆异位表达与大肠癌临床分期和淋巴结转移有关(P＜0.01、P＜0.05).结论 APE1胞浆异位表达可能在大肠癌的发生、发展中起重要作用.
关键词： 脱嘌呤/脱嘧啶核酸内切酶 氧化还原因子-1 大肠癌 -
丹参对缺氧缺血新生大鼠脑皮质氧化还原因子-1蛋白和凋亡细胞的影响
目的研究丹参对缺氧缺血性新生大鼠脑皮质氧化还原因子-1(redoxfactor-1,Ref-1)蛋白和凋亡细胞的影响.方法将新生7日龄SD大鼠制成缺氧缺血性脑损伤(HIBD)动物模型,采用免疫组织化学方法及原位缺口末端标记(TUNEL)法分别观察假手术组、缺氧缺血组及丹参治疗组脑皮质Ref-1蛋白及神经细胞凋亡变化.结果与缺氧缺血组比较,丹参治疗组Ref-1蛋白表达Ref-1阳性细胞数增加(由36.1±6.3上升至76.3±5.4,t=2.43,P＜0.05);而凋亡细胞显著减少(由68±2降至12±5,t=7.02,P＜0.01).结论丹参作为自由基清除剂可能通过促进缺氧缺血后脑神经细胞Ref-1蛋白的表达,从而抑制了细胞凋亡,为治疗新生儿缺氧缺血性脑病提供新的理论依据.
