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实时荧光定量PCR法快速诊断肺炎链球菌及其血清分型方法的建立
目的:探讨建立荧光定量PCR法直接检测临床标本的肺炎链球菌并对其进行血清学分型的可行性.方法:针对肺炎链球菌种属特异性基因lytA及该菌常见的21种血清型设计荧光探针及引物,构建Taqman荧光定量PCR法.使用荚膜肿胀试验作为金标准检测PCR方法的灵敏度及特异度,选择1209份临床样本同时做培养及PCR方法,比较两种方法的肺炎链球菌检出率及血清分型情况.结果:构建Taqman荧光定量PCR法灵敏度及特异度分别为94.2％及70％.Taqman荧光探针PCR法鉴定的主要血清型别为19F(43.7％)、6A/B (17.2％)、23F (13.8％)、19A(6.8％),未能分型的肺炎链球菌为17.2％.荚膜肿胀试验鉴定的主要血清型别为19F(39.1％)、6A/B(17.2％)、23F(9.2％)、19A(5.7％),未能分型的肺炎链球菌为28.7％.1209份临床样本仅培养出16份肺炎链球菌,Taqman荧光定量PCR法检出44例肺炎链球菌,其对临床样本肺炎链球菌阳性检出率更高,其差异有显著统计学意义(x-2=13.39,P＜0.001).结论:Taqman荧光探针PCR法灵敏度高、特异度好,能直接对临床样本进行血清学分型,可大幅度缩短肺炎链球菌检测的报告时间.
关键词： Taqman荧光探针PCR法 肺炎链球菌 血清分型 荚膜肿胀试验 -
改良荚膜肿胀试验
背景:有研究证实白色念珠菌细胞壁外发现有一层分泌的蛋白质,而近实验发现其具有荚膜结构.目的:通过改良荚膜肿胀试验观察白色念珠菌的荚膜结构.设计:观察对比实验.单位:赣南医学院病原生物学教研室.材料:菌株:中央标准株(菌号:CCCMC1a)由中科院真菌菌种保藏中心提供;国际标准株(菌号:ATCC 14053)由北京大学医院真菌菌种保藏中心提供.2株临床分离菌株(C1、C2),经中科院真菌菌种保藏中心鉴定为白假丝酵母菌.免疫血清用上述实验菌株全细胞抗原分别免疫家兔(由中山大学动物实验中心提供),常规制备免疫血清,备作荚膜肿胀试验用.方法:实验于2005-12在赣南医学院病原生物学教研室完成.①荚膜肿胀实验:将白色念珠菌培养物(C1,C2,CCCMC1a,ATCC)分别涂片,实验组1玻片加入相应的兔抗血清,对照组1加入正常兔血清,两组都加入1%美蓝置湿盒,37℃,20 min;取出玻片,盖上盖玻片,在油镜下用测微计测定40个菌细胞的荚膜厚度,计算平均值.②改良荚膜肿胀实验:将白色念珠菌培养物(C1,C2,CCCMC1a,ATCC)分别涂片,实验组2玻片加入相应的兔抗血清,对照组2加入正常兔血清,不加美蓝直接置湿盒内,37℃,20 min;取出玻片,不盖盖玻片,待其自然干燥,然后用HISS荚膜染色法进行染色,同样在油镜下用测微计测定40个菌细胞的荚膜厚度,计算平均值.主要观察指标:荚膜肿胀实验及改良荚膜肿胀实验各组荚膜厚度平均值.结果:①传统荚膜肿胀实验表现为阳性,实验组1白色念珠菌培养物C1,C2,CCCMC1a,ATCC荚膜厚度分别为(0.558+0.081),(0.530+0.081),(0.475+0.081),(0.600+0.068)μm,均大于对照组1[(0.225+0.061),(0.252+0.038),(0.200+0.072),(0.225+0.046)μm,P＜0.01].②改良荚膜肿胀实验组2白色念珠菌培养物C1,C2,CCCMC1a,ATCC荚膜厚度分别为(0.541±0.038),(0.510±0.060),(0.487±0.041),(0.595±0.027)μm,大于对照组2[(0.215±0.022),(0.247±0.018),(0.213±0.033),(0.220±0.016)μm,P＜0.01].③对照组2荚膜厚度小于对照组1(P＜0.01),实验组2荚膜厚度小于实验组1(P＜0.01).结论:作为一种定量试验,改良荚膜肿胀试验比传统荚膜肿胀试验更为稳定与准确.
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多重聚合酶链反应与荚膜肿胀试验对肺炎链球菌血清分型的比较研究
为评估多重聚合酶链反应（PCR ）对肺炎链球菌血清分型的可行性，分别采用多重PCR和荚膜肿胀试验对568株肺炎链球菌进行血清分型，并对分型结果进行比较分析。结果显示，568株肺炎链球菌中，213株通过荚膜肿胀试验分出16个血清群，主要有血清群19（23．1％，131／568）、6（5．3％，30／568）、23（1．6％，9／568）、14（1．4％，8／568）、9（1．1％，6／568）、15（1．1％，6／568）等，分型率为37．5％（213／568）；356株通过多重PCR分出21个血清群，主要有血清群19（27．8％，158／568）、23（8．5％，48／568）、6（7．4％，42／568）、14（4．4％，25／568）、3（4．2％，24／568）、15（3．5％，20／568）等，分型率为62．7％（356／568）。荚膜肿胀试验鉴定出血清群4和18，但多重PCR未能鉴定；多重PCR鉴定出血清群5、12、35、16、17和22，但荚膜肿胀试验未能鉴定。多重PCR与荚膜肿胀试验对19F、19A血清型的鉴定无显著差异。结果提示，这2种方法对肺炎链球菌血清分型结果有差别，多重PCR的分型率高于荚膜肿胀试验。对来源复杂的标本进行肺炎链球菌血清分型，2种方法可相互补充，以提高分型率。
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2004-2009年益阳市中心医院临床分离肺炎链球菌的血清型/群分布及耐药性监测
目的 了解近5年益阳市中心医院临床分离肺炎链球菌的血清型/群分布及耐药趋势,为临床合理使用抗生素提供参考.方法 以2004-2009年期间临床分离的822株肺炎链球菌为研究对象,采用荚膜肿胀试验进行血清分型/群,E-test检测菌种对青霉素、头孢呋辛、头孢地尼、头孢克罗、红霉素、四环素、左氧氟沙星、万古霉素等8种抗生素的敏感性.结果 2004年青霉素不敏感肺炎链球菌(PNSP)的分离率为49.4%,并呈逐年上升趋势,至2006年PNSP分离率高达67.8%,2009年下降至51.5%.822株肺炎链球菌常见的型/群是19群,其次是23、6、14、3群和其他.PNSP在6种血清型/群中所占的比例在2004-2009年期间无显著性变化(P>0.05).肺炎链球菌对其他β内酰胺类抗生素的非敏感趋势类似青霉素,对红霉素、四环素的非敏感率始终在60%以上,其中青霉素耐药肺炎链球菌(PRSP)对红霉素和四环素几乎100%耐药,对左氧氟沙星、万古霉素的非敏感率均＜3%.结论 临床分离肺炎链球菌以19、23、6、14、3群常见;对β内酰胺类抗生素的非敏感率自2007年呈下降趋势,且对左氧氟沙星、万古霉素始终具有较高的敏感性.
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感染性肺炎病原学实验室诊断——肺炎链球菌检测技术进展
肺炎链球菌(Streptococcus pneumonia,SP)是感染性肺炎重要的病原微生物之一.而且,SP感染及其耐药现象日趋严重.我国每年因SP感染相关性疾病是导致5岁以下儿童死亡病例数多的国家.因此,临床上及时、准确地诊断SP感染性肺炎尤为重要.本文综述了SP的生物学特性、致病机制,及其实验室检测技术的研究进展.SP等感染性疾病的早期、精准、全面、高效的实验室诊断是临床微生物学检验及研究者面临的重要课题,也是对临床微生物学检验者的挑战.
