犬贾第虫病毒转染载体介导的锤头状核酶对KRR1基因体外转录体切割效果的研究
摘要： 目的 检测犬贾第虫病毒介导的锤头状核酶对犬贾第虫滋养体核仁功能性蛋白KRR1基因体外转录体切割效率.方法 将两端携带反义KRR1基因的锤头状核酶(ribozyme,R酶)插入犬贾第虫病毒(Giardia canis virus,GCV)转染载体中,构建两个核酶嵌合型犬贾第虫病毒载体:短反义序列,上游及下游均为21个碱基,形成重组质粒KRzS;长反义序列,上游为288个碱基,下游为507个碱基,形成重组质粒KRzL.另设两种阴性对照,即重组质粒TRzL(即R酶两端含虫体反义磷酸丙糖异构酶基因,上游为324个碱基,下游为380个碱基)和重组质粒PKR(即犬贾第虫病毒转染载体中仅有KRR1基因的反义片段而无R酶功能区).应用荧光实时定量RT-PCR法检测嵌合型锤头状核酶体外对KRR1基因mRNA切割活性.结果 KRzS、KRzL转录体对KRR1基因体外转录RNA切割效率分别达到74.0%和81.1%.而PKR对KRR1 mRNA反转录的影响较小,RT-PCR效率仅降低12.0%.TRzL对KRR1 mRNA反转录几乎无影响.结论 犬贾第虫病毒介导的锤头状核酶对KRR1基因体外转录体能进行有效切割,为以后的体内锤头状核酶对KRR1基因表达抑制试验提供依据.
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鼠细粒棘球蚴囊壁消化残片的生发细胞培养试验
目的 建立高效、经济的细粒棘球蚴生发细胞原代培养方法.方法 采用0.25％胰蛋白酶-EDTA溶液消化鼠细粒棘球蚴囊壁10～30 min,以消化后的棘球蚴囊壁残片进行组织贴壁培养原代生发细胞,以单纯组织贴壁培养法作为对照.用倒置显微镜观察生发细胞形态学动态变化,绘制生长曲线.免疫荧光试验鉴定获得的生发细胞.取残片培养的生发细胞进行小鼠腹腔返种,4个月后剖检小鼠,观察小鼠感染情况;取病变组织制石蜡切片、HE染色后,镜下观察棘球蚴囊壁生长情况.结果 0.25％胰蛋白酶-EDTA溶液消化10 min囊壁残片中的生发细胞的完整性好,胞浆丰富,2～4d后囊壁残片边缘游离出生发细胞,生发细胞培养9d后呈现集落样生长状态.0.25％胰蛋白酶-EDTA溶液消化20 min、30 min的囊壁残片中的生发细胞破碎并出现裸核.采用0.25％胰蛋白酶-EDTA溶液消化10 min的残片培养法培养生发细胞的成功率(6/10)高于单纯组织贴壁法(3/10);两种方法生长曲线均近似“S”形,残片培养法周期较短(18 d),残片培养法培养的生发细胞生长增殖水平高于单纯贴壁培养法(P＜0.01).免疫荧光结果显示,残片培养法培养18 d的生发细胞可被感染棘球蚴的人阳性血清中的抗棘球蚴抗体识别.残片培养法培养的生发细胞返种结果显示,小鼠腹腔有新生的棘球蚴囊状结构出现.HE染色结果显示,镜下可观察到发育中的棘球蚴囊壁角质层和生发层.结论 建立的0.25％胰蛋白酶-EDTA溶液消化10 min的鼠源棘球蚴囊壁残片贴壁培养法可培养出活性正常的生发细胞,并能感染小鼠.
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日本血吸虫感染小鼠肝脏和脾脏淋巴细胞及其表面程序性死亡配体1表达动态变化的研究
目的 初步研究日本血吸虫感染对小鼠肝脏和脾脏淋巴细胞数量及其表面程序性死亡配体1(PD-L1)功能的影响.方法 30只BALB/c小鼠随机分为感染组和未感染组,每组15只,感染组小鼠经腹部皮肤感染日本血吸虫尾蚴(20±2)条/鼠.感染后2、4、6、8和10周,分别随机取两组小鼠各3只,颈椎脱臼处死小鼠,分离小鼠肝脏和脾脏的淋巴细胞,采用流式细胞术检测CD3+T细胞(CD3+CD19-)、CD19+B细胞(CD3-CD 19+)、CD4+T细胞(CD3+CD19-CD4+CD8-)和CD8+T细胞(CD3+CD19-CD4-CD8+)淋巴细胞比例的动态变化,以及这些细胞群上的PD-L1表达变化.组间差异比较采用ANOVA检验.结果 感染日本血吸虫后4～8周,小鼠肝脏和脾脏中的CD3+T细胞、CD19+B细胞和CD4+T细胞比例均低于未感染组(P＜0.05或0.01,P＞ 0.05).感染日本血吸虫后6周的小鼠肝脏中CD8+T细胞比例增加[(38.03±7.41)％],与未感染组[(23.37±3.98)％]比较,差异有统计学意义(P＜0.01);但脾脏中无明显变化.在感染日本血吸虫后6周,小鼠肝脏中CD19+B细胞上PD-L1的表达被显著抑制[(7.25±3.47)％],与未感染组[(22.77±8.90)％]比较,差异有统计学意义(P＜0.01);脾脏相对肝脏较晚,感染后8周CD19+B细胞上PD-L1的表达被抑制[(22.37±4.01)％],与未感染组[(51.97±1.62) ％]比较,差异有统计学意义(P＜0.01),且此后在肝脏和脾脏中保持低水平表达.感染后2～10周,肝脏中的CD3+T和CD4+T细胞表面PD-L1的表达低于未感染组(P＜0.05或0.01,P＞0.05),脾脏中的CD3+T和CD4+T细胞表面PD-L1的表达分别于感染后4～8周和6～10周低于未感染组(P＜0.05).肝脏和脾脏中CD8+T细胞上PD-L1的表达在感染早期无变化,感染后10周比例增加,为(34.80±3.68)％、(31.90±2.53)％,与未感染组[(25.5±0.80)％、(29.91±3.55)％]比较,差异有统计学意义(P＜0.01).结论 日本血吸虫感染BALB/c小鼠后,肝脏和脾脏中CD19+B、CD3+T和CD4+T淋巴细胞亚群的比例显著降低,但对CD8+T细胞比例影响不明显.感染对PD-L1在上述淋巴细胞亚群的表达也有相同的变化,在CD19+B、CD3+T和CD4+T细胞上表达受抑制,在CD8+T细胞上的表达影响较小,且肝脏局部淋巴细胞的变化早于脾脏.
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98例复杂性肝多房棘球蚴病外科治疗方案的比较分析
目的 探讨复杂性肝多房棘球蚴病的临床治疗策略,总结治疗经验.方法 回顾性分析2015年10月至2017年10月青海大学附属医院收治的复杂性多房棘球蚴病患者资料,根据病灶分布情况,将中晚期或晚期患者纳入本研究,排除肝细粒棘球蚴病患者、早期肝多房棘球蚴病患者、仅行阿苯达唑药物治疗的患者.按照治疗方式分为准根治性切除组、姑息性切除组、肝移植组,分析患者的手术时间、术中出血量、术后并发症及复发随访情况.应用SPSS 20.0统计学软件对数据进行统计分析.结果 符合纳入标准的患者98例,其中男40例,女58例,男女性别比1∶1.45;患者年龄5～72岁,平均年龄38岁.准根治性切除组术后并发症发生率为55.7％ (34/61),其中低蛋白血症伴胸腔积液18例、肺部感染9例、切口感染3例、胆漏4例;术后复发率14.8％(9/61),随访期间死亡3例.姑息性切除组术后并发症发生率41.4％ (12/29),其中胆漏合并残腔感染5例、肺部感染伴胸腔积液3例、2例梗阻性黄疸、1例切口感染、1例胆管-支气管漏;术后复发率17.2％ (9/29),随访期间死亡3例.准根治性切除与姑息性切除组术后并发症和复发率相比较无统计学意义(P＞0.05),但在手术时间及出血量方面的差异具有统计学意义(P＜0.05).肝移植组8例患者中,有4例死亡,包括1例急性排斥反应后多器官功能衰竭、2例凝血功能障碍致消化道出血、1例肝肾综合症,余4例患者均获得长期生存.结论 复杂性肝多房棘球蚴病应针对患者病情制定个体化治疗方案,结合多学科诊疗模式,遵循损伤控制外科原则,以使患者大化获益.
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大片形吸虫排泄分泌产物对体外培养LO2人肝细胞的影响
目的 初步探讨大片形吸虫排泄分泌产物(FgESP)对体外培养LO2人肝细胞的增殖及对肝细胞损伤相关的生化指标的影响.方法 将LO2人肝细胞分为5个密度组(1 000、3 000、5 000、7 000、10 000个/孔),铺于96孔板中,空白对照组只加入培养基,根据LO2细胞生长曲线选择适细胞铺板密度.在96孔板中,以适细胞密度铺板,分为0.02、0.10、0.20、0.40、1.00 mg/ml FgESP等5组,每组设4个重复,以PBS作为阴性对照组,在培养箱中孵育4、8、12、24、48和72 h后进行MTT细胞活性检测,测吸光度(A490值).在24孔板中,分为0.02、0.10、0.20、0.40、1.00 mg/ml FgESP等5组,每组设3个重复,以PBS作为阴性对照组,分别在培养4、8、12、24、48和72 h后,收集LO2细胞上清,测定碱性磷酸酶(ALP)、天门冬氨酸氨基转移酶(AST)、丙氨酸氨基转氨酶(ALT)、白蛋白(ALB)的含量.采用GraphPad Prism 6.0软件进行统计学分析.结果 根据LO2人肝细胞生长曲线,筛选出5 000个/孔为96孔板佳铺板密度.FgESP作用72 h后,MTT细胞活性检测结果显示,0.02、0.10、0.20、0.40、1.00 mg/ml FgESP等5组的A 490值分别为1.29±0.01、1.28±0.06、1.13±0.08、0.97±0.06、0.25±0.01,均低于对照组(1.45±0.05) (P＜ 0.01).生化指标检测结果显示,0.40、1.00 mg/ml FgESP作用细胞LO2人肝72 h后,ALT含量分别为2.00±0.00、3.67±0.58,AST含量分别为5.33±0.58、7.67±0.58,均高于对照组的(P＜0.01);作用48 h后,1.00 mg/ml FgESP组ALT、AST含量分别为2.00±0.00、7.00±0.00,高于对照组的0.33±0.58、3.67±0.58 (P＜ 0.01);在12～72 h内,0.10、0.20、0.40、1.00 mg/mlFgESP作用后ALP含量升高(P＜0.01),而0.02 mg/ml FgESP仅在作用72 h后ALP含量升高(P＜0.01);各实验组ALB含量与阴性对照组差异无统计学意义(P＞0.05).结论 FgESP体外作用可抑制LO2人肝细胞增殖能力,且细胞增殖的抑制及损伤程度与FgESP的浓度相关.
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屋尘螨3类变应原基因的克隆、表达及免疫原性分析
目的 克隆、表达屋尘螨3类变应原(Der p 3)基因,纯化Der p 3重组蛋白,对其免疫原性及生物信息学特点进行分析.方法 取实验室纯培养的屋尘螨500只,提取总RNA,逆转录生成eDNA,RT-PCR扩增Der p 3基因.扩增的Der p 3基因经测序正确后,将目的条带连接至pMD-32T载体中进行扩增,并利用限制性内切酶EcoR Ⅰ和Xho Ⅰ双酶切,酶切后的片段连接至pET-32a表达载体,转化至大肠埃希菌Rosetta中,经1 mmol/L异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达后,蛋白质印迹(Western boltting)分析重组蛋白的免疫原性.分别采用BLAST、ProtParam、PSIPRED、SWISS-MODEL对重组蛋白的同源性、理化性质、二级结构、三级结构进行分析;通过BLAST和MEGA构建Der p 3的系统进化树;并利用IEBD和DNA Star对Der p 3重组蛋白的抗原表位进行预测.结果 RT-PCR扩增屋尘螨Der p 3基因,得到约1 000 bp的片段,经测序为Derp 3目的序列,其开放阅读框为786 bp,编码261个氨基酸.经IPTG诱导后大量表达Derp3重组蛋白.该蛋白主要以包涵体形式存在,相对分子质量(Mt)约30 000.Western blotting分析结果显示,重组蛋白Derp 3能与10份尘螨过敏性哮喘息者血清IgE抗体特异性结合.BLAST和MEGA分析结果显示,Der p 3基因与粉尘螨3类变应原(Der f 3)的序列一致性较高,约80％.Der p 3蛋白较稳定,二级结构由螺旋、延伸链、随机线圈组成;并预测到6个抗原表位肽序列.结论 纯化后的Derp 3重组蛋白能与尘螨过敏性哮喘患者血清IgE抗体特异性结合,具有较强免疫原性.
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2011-2017年内蒙古自治区棘球蚴病流行特征分析
目的 了解2011-2017年内蒙古自治区棘球蚴病疫情分布状况及流行特点,为制定防治策略和措施提供依据.方法 收集中国疾病预防控制中心传染病报告信息管理系统中2011-2017年棘球蚴病病例数据,采用SPSS 20.0统计学软件对报告病例的时间分布、地区分布、人群分布等进行描述性统计分析,使用QGIS3.4.2软件绘制病例分布地图.结果 2011-2017年报告棘球蚴病病例总数为543例,各年病例数分别为117、89、69、81、62、62和63例,报告发病率呈逐年下降的趋势(P＜0.05),由2011年的0.48/10万下降至2017年的0.25/10万.共确定了25个棘球蚴病流行县,报告的397例为流行县的本地感染病例,占73.11％.全区12个盟(市)的74个县均有报告病例,报告发病率较高的为锡林郭勒盟和阿拉善盟,分别为5.14/10万和2.42/10万.报告病例中,男性255例,女性288例,男女年均报告发病率分别为1.97/10万、2.41/10万,两者差异有统计学意义(P＜0.05).40～49岁年龄组的报告病例数多(128例,31.50％);报告病例主要集中在30～59岁,占报告病例总数的74.03％ (402/543).报告病例中,牧民、农民和家务及待业人群较多,分别为192例、131例和111例,分别占报告病例总数的35.36％、24.13％和20.44％.结论 内蒙古自治区棘球蚴病报告病例呈散发分布,主要以牧区和半农半牧地区为主,女性、青中年、牧民为高发人群.
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新疆塔城地区棘球蚴病流行现状调查
目的 了解和掌握新疆塔城地区棘球蚴病的流行现状.方法 于2015-2017年随机选择塔城地区塔城市、乌苏市、额敏县、沙湾县、托里县、裕民县和和丰县等7个县(市)的6岁及以上儿童和居民进行腹部B超检查棘球蚴病患病情况.每县随机抽取1～2所小学,B超检查6～12岁儿童棘球蚴患病情况,并采集血样,ELISA检测血清抗棘球蚴IgG抗体.各调查点采集家犬粪样,ELISA检测棘球绦虫粪抗原.采用内脏剖检法检查家畜棘球蚴感染情况.结果 共B超检查277 615人,人群棘球蚴病检出率为0.25％ (683/277 615),均为细粒棘球蚴病病例.2015-2017年人群棘球蚴病检出率分别为0.15％ (131/84 882)、0.23％ (238/101 509)和0.34％(314/91 224),呈逐年上升趋势(P＜ 0.005).7个县(市)均存在棘球蚴病流行,以和丰县较高,人群棘球蚴病检出率为0.56％ (65/11 606),不同县(市)检出率差异有统计学意义(P＜0.01).男性和女性棘球蚴病检出率分别为0.24％ (345/141 584)和0.25％ (338/136 031),两者差异无统计学意义(P＞0.05).不同年龄组中,人群棘球蚴病检出率以35～59年龄组较高,为0.35％ (113/31 843);各年龄组检出率差异有统计学意义(P＜0.01).不同职业中,人群棘球蚴病检出率以农民较高,为0.41％ (365/88 411);不同职业人群检出率差异有统计学意义(P＜ 0.01).共检测儿童血清18 560份,血清抗棘球蚴IgG抗体阳性190份,阳性率为1.02％,呈逐年上升趋势(2015年:0.60％,49/8 167;2016年:0.71％,43/6 034;2017年:2.24％,98/4 359) (P＜0.01);不同县(市)儿童血清抗体阳性率以和丰县较高,为3.16％ (60/1 900) (P＜ 0.01).共检测犬粪34 343份,粪抗原阳性率为1.04％ (356/34 343),以2016年较高,为1.71％ (206/11 824),3年的犬粪抗原阳性率差异有统计学意义(P＜0.01);各县(市)均检出犬粪抗原阳性,以和丰县较高,为3.16％ (98/3 100) (P＜0.01).共检查家畜(羊)4 008只,棘球蚴感染检出率为1.05％ (42/4 008),其中,2015年家畜感染检出率较高,为1.67％(30/1 800),3年的感染检出率差异有统计学意义(P＜0.01).结论 2015-2017年新疆塔城地区人群棘球蚴病检出率、儿童血清抗棘球蚴抗体阳性率、犬粪棘球绦虫抗原阳性率呈不同程度的上升趋势.
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广西宾阳县和灵山县水源隐孢子虫和蓝氏贾第鞭毛虫污染调查
目的 了解广西壮族自治区宾阳县和灵山县水源中隐孢子虫和蓝氏贾第鞭毛虫(简称贾第虫)的污染情况.方法 利用质控标样检验碳酸钙絮凝和膜过滤富集隐孢子虫卵囊、贾第虫包囊的回收率,并与我国的国标方法比较.2016、2017年6-9月,采集广西壮族自治区宾阳县(自来水厂A、B、C、D和E)和灵山县(自来水厂F、G、H、I和J)10个自来水厂的进水和出厂水水样,应用碳酸钙絮凝法富集进水中隐孢子虫卵囊和贾第虫包囊,膜过滤法富集出厂水中隐孢子虫卵囊和贾第虫包囊;富集后用磁珠分选和荧光染色检测隐孢子虫卵囊和贾第虫包囊,计算水样中隐孢子虫卵囊和贾第虫包囊的密度.结果 碳酸钙絮凝法富集质控标样隐孢子虫卵囊和贾第虫包囊的回收率分别为48.5％和52.0％,膜过滤法为35.0％和36.5％,国标方法为15.0％和16.0％,碳酸钙絮凝法、膜过滤法的回收率均高于我国国标方法,差异具有统计学意义(碳酸钙絮凝法:x2=26.007、28.877,均P＜0.01;膜过滤法:x2=8.167、11.019,均P＜0.01).10个自来水厂中,每个自来水厂采集进水和出厂水水样各2份.检测结果显示:自来水厂A的进水、B的进水和出厂水、C和F的出厂水中检出隐孢子虫卵囊,密度分别为4.0、10.0、0.6、2.9、5.1个/10L;自来水厂F的出厂水中检出贾第虫包囊,密度为9.3个/10 L.其余自来水厂的进水和出厂水均未检出隐孢子虫和贾第虫.结论 广西壮族自治区宾阳县和灵山县部分自来水厂的进水或出厂水中存在隐孢子虫或贾第虫污染,需加强农村地区饮用水隐孢子虫和贾第虫的监测.
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上海市动物园蛇曼氏裂头蚴感染情况
目的 了解上海市动物园蛇曼氏裂头蚴感染情况.方法 2017年对上海市动物园送检的30条蛇进行解剖检查,分离曼氏裂头蚴,记录寄生部位和数量;新鲜虫体经盐酸卡红染色后,于显微镜下进行形态学鉴定.提取虫体基因组DNA,PCR扩增曼氏裂头蚴线粒体基因细胞色素c氧化酶亚单位1(cytochrome c oxidase subunit 1,cox1)、细胞色素b(cytochrome b,cytb),并进行测序分析.结果 上海市动物园送检蛇的裂头蚴总感染率为86.7％ (26/30),共检获裂头蚴626条,感染度为24.1条/蛇.其中6条王锦蛇中有3条感染裂头蚴,感染度为1.33条/蛇;乌梢蛇的感染率为95.8％ (23/24),感染度为27.0条/蛇.裂头蚴主要寄生于蛇肌肉组织,占总数的52.9％ (331/626).显微镜下观察,所获虫体具有曼氏裂头蚴的形态特征.cox1基因和cytb基因的PCR扩增产物分别约为470 bp和1 400 bp.对26条蛇中分离的裂头蚴cox1和cytb基因序列一致性分析结果显示,cox1基因的序列一致性为96.4％～100％,cytb基因的为97.8％～100％.与GenBank中的绦虫序列进行比对,发现其与欧猥迭宫绦虫(GenBank登录号为KP738288、AB374543)的序列一致性为99.8％～100％,与其他种类绦虫的序列一致性为54.2％～84.4％.结论 上海市动物园送检蛇的曼氏裂头蚴感染率较高,蛇的曼氏裂头蚴可感染人类,需加强防控.
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1996-2017年浙江省输入性血吸虫病病例的流行病学调查分析
目的 分析浙江省1995年达到血吸虫病传播阻断标准后输入性疫情动态变化及其影响因素.方法 采用回顾性调查法收集1996-2017年浙江省输入性血吸虫病疫情、本地螺情等资料,建立数据库,对病例三间分布、感染状况、诊疗情况和螺情风险因素进行分析.结果 1996-2017年浙江省30个县(市、区)共报告输入性血吸虫病病例245例,包括急性病例41例.其中241例为国内其他省份输入,主要来自毗邻的江西省和安徽省,分别占37.3％ (390/241)和29.9％ (72/241);境外输入埃及血吸虫病病例3例和曼氏血吸虫病病例1例,均来自非洲的尼日利亚.输入性病例数在2005年之前呈上升趋势,之后呈下降趋势.每年下半年报告的输入性病例数较多,合计占总报告输入性病例数的80.8％ (198/245).全省共30个县(市、区)有输入性血吸虫病病例报告,其中杭州、宁波、嘉兴、湖州、绍兴、金华、衢州和台州8个历史流行市25个流行县累计报告输入性病例230例,5个非流行县报告输入性病例15例.输入性血吸虫病病例报告多的为宁波市,占55.9％ (137/245),杭州市和衢州市次之,分别占18.4％ (45/245)和6.9％ (17/245).245例病例中,男性180例,女性65例;学历以初中和小学为主,分别占49.4％ (121/245)和29.8％ (73/245);职业以农民、工人和学生为主,分别为42.0％ (103/245)、23.3％ (54/245)和14.7％ (36/245).国内其他省份输入的241例病例中,85.1％ (205/241)的病例感染地为当年的血吸虫病未控制地区或疫情回升地区,12.4％ (30/241)的病例感染地为当年的血吸虫病传播控制地区.感染方式以游泳戏水和农业生产用水接触为主,分别占37.1％ (91/245)和36.3％ (89/245).疾病预防控制机构主动监测查病报告病例占51.4％ (126/245),医院被动报病报告病例占48.6％ (119/245).病例首诊医疗机构以县级多,为59.6％ (146/245),被动报病中有49.6％ (59/119)存在首诊误诊情况.全省除宁波、丽水市外,累计有7个市30个流行县发现有钉螺孳生,累计查到有螺面积1 739.0 hm2.结论 1996-2017年浙江省通过主动监测和被动报病共发现输入性血吸虫病病例245例,年病例数自2005后逐年下降,主要感染地为国内当年的血吸虫病未控制地区或疫情回升地区.
