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蓝氏贾第鞭毛虫alpha-8贾第素特异性锤头状核酶-GCV重组载体的构建
目的 构建蓝氏贾第鞭毛虫alpha-8贾第素(α-8 giardin)特异性锤头状核酶-GCV重组载体. 方法 采用RNA draw软件对蓝氏贾第鞭毛虫α-8贾第素基因序列(GenBank登录号为AY781323)的二级结构进行模拟分析,按照G:C比例和锤头状核酶设计原则,选取合适的核酶切割靶点,设计特异性锤头状核酶(H8)序列,并将其与犬贾第虫病毒(GCV)连接,获得α-8贾第素特异性锤头状核酶-GCV重组载体(pGCV634/H8/1423).将载体线性化体外转录产物电击转染至贾第虫滋养体细胞内.提取转染后24 h的各组虫体总RNA,并以其为模板采用RT-PCR验证转染效果及对靶mRNA的切割效果. 结果 成功设计、合成了蓝氏贾第鞭毛虫α-8贾第素mRNA锤头状核酶序列(H8),将其与犬贾第虫病毒载体(GCV)连接,成功构建了pGCV634/H8/1423；RT-PCR实验结果表明,重组载体pGCV634/H8/1423转染贾第虫细胞后24 h可检测到核酶RNA的存在,并实现了对α-8贾第素mRNA高效、特异的切割作用. 结论 构建的pGCV634/H8/1423能有效转染至贾第虫细胞内,并在其细胞内对α-8贾第素基因的mRNA具有高效、特异的切割作用.
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蓝氏贾第鞭毛虫丙酮酸激酶特异性锤头状核酶-GCV重组载体的构建
目的 构建蓝氏贾第鞭毛虫丙酮酸激酶(pyruvate kinase, PK)特异性锤头状核酶-犬贾第虫病毒(Giardia canis virus, GCV)重组载体. 方法 采用RNA draw软件分析贾第虫编码丙酮酸激酶的基因序列,并设计特异性反义锤头状核酶(PKH)序列, 将其与犬贾第虫病毒(GCV)连接,构建重组载体pGCV-PKH.将重组载体线性化体外转录产物,分别进行贾第虫细胞外、细胞内目的 mRNA切割实验,采用荧光显微镜观察转染后24 h的各组虫体.采用实时PCR对切割产物进行相对定量分析. 结果 构建了载有蓝氏贾第鞭毛虫丙酮酸激酶特异性锤头状核酶的犬贾第虫病毒重组载体pGCV-PKH.细胞内切割实验结果表明,荧光显微镜下只有pGCV-GFP转染组虫体显示绿色荧光,pGCV-PKH转染组丙酮酸激酶mRNA的相对含量约为正常对照组的33.14%.细胞外切割实验结果表明,该组载体能在细胞外有效切割丙酮酸激酶mRNA,在设定条件下,其切割效率为58.5%. 结论 重组载体pGCV-PKH能有效转染蓝氏贾第鞭毛虫细胞,并能在其细胞内外对丙酮酸激酶mRNA进行有效切割.
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犬贾第虫病毒转染载体介导的锤头状核酶对KRR1基因体外转录体切割效果的研究
目的 检测犬贾第虫病毒介导的锤头状核酶对犬贾第虫滋养体核仁功能性蛋白KRR1基因体外转录体切割效率.方法 将两端携带反义KRR1基因的锤头状核酶(ribozyme,R酶)插入犬贾第虫病毒(Giardia canis virus,GCV)转染载体中,构建两个核酶嵌合型犬贾第虫病毒载体:短反义序列,上游及下游均为21个碱基,形成重组质粒KRzS;长反义序列,上游为288个碱基,下游为507个碱基,形成重组质粒KRzL.另设两种阴性对照,即重组质粒TRzL(即R酶两端含虫体反义磷酸丙糖异构酶基因,上游为324个碱基,下游为380个碱基)和重组质粒PKR(即犬贾第虫病毒转染载体中仅有KRR1基因的反义片段而无R酶功能区).应用荧光实时定量RT-PCR法检测嵌合型锤头状核酶体外对KRR1基因mRNA切割活性.结果 KRzS、KRzL转录体对KRR1基因体外转录RNA切割效率分别达到74.0%和81.1%.而PKR对KRR1 mRNA反转录的影响较小,RT-PCR效率仅降低12.0%.TRzL对KRR1 mRNA反转录几乎无影响.结论 犬贾第虫病毒介导的锤头状核酶对KRR1基因体外转录体能进行有效切割,为以后的体内锤头状核酶对KRR1基因表达抑制试验提供依据.
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犬贾第虫携病毒株体外纯培养的建立
目的 培养一携带犬贾第虫病毒的犬贾第虫(Giardia canis)细胞株.方法 用蔗糖密度梯度离心-G1耐酸漏斗过滤法纯化犬贾第虫包囊,经口接种5日龄长爪沙鼠(Meriones unguiculata),8 d后于其十二指肠无菌收集犬贾第虫滋养体,置改良的TYI-S-33培养基中培养,待滋养体在培养管壁上形成细胞单层后进行传代.同时进行冻存和复苏实验,以及纯度、稳定性、细胞生物学特性、微生物污染等4项指标检测.滋养体经液氮冻融3次后3 000×g离心15min,取上清,用磷钨酸负染,透射电镜观察病毒粒子.结果 犬贾第虫滋养体接种14 d后虫体逐渐适应了培养环境,在培养管壁上形成细胞单层,经上述4项指标检测,证明形成了稳定的犬贾第虫细胞株.电镜观察,见滋养体内有外观球形呈20面体结构、直径约为36 nm的病毒样粒子.结论 建立了携带GCV的犬贾第虫细胞株的体外纯培养.
关键词： 犬贾第虫病毒 体外培养 改良TYI-S-33培养基 -
犬贾第虫病毒转染载体介导的绿色荧光蛋白在犬贾第虫体内的表达
目的 构建犬贾第虫病毒(Giardia canis virus,GCV)转染载体.方法 根据GCV基因组(DQ238861)的转录起始位点、复制起始位点及包装位点的序列特征和表达外源基因的顺式作用元件,将绿色荧光蛋白(GFP)基因替换GCV基因部分编码区,构建CCV基因与GFP基因的嵌合体,并置T7启动子之下.用T7 RNA聚合酶体外转录后经电穿孔转染犬贾第虫滋养体,并用荧光显微镜检测GFP表达情况,间接ELISA测定转染后CFP的表达量.结果 构建了犬贾第虫病毒重组质粒pGCV634/GFP/GCV2174,经Sac Ⅰ和Not Ⅰ双酶切得到约2.0和3.5 kb两条带,与预计值相符.由其介导的绿色荧光蛋白在犬贾第虫体内得到了高效表达,其表达量在转染后第1天达高峰(A490=1.8);以后随时间的延长而逐渐下降,14 d后绿色荧光信号基本消失.结论 成功构建了犬贾第虫病毒转染载体,为贾第虫细胞基因表达调控的研究提供了方法.
