EMA实时荧光PCR技术检测食品中单核增生李斯特活菌方法研究
摘要： 目的 利用叠氮溴化乙錠(EMA)实时荧光PCR技术,建立直接检测食品中单增李斯特活菌的方法.方法 根据单核李斯特菌inlA基因设计特异性引物和探针.用不同EMA浓度、不同光照次数优化样品前处理条件.用平板计数法验证该方法的检出限及对死菌的抑制率.用35株单增李斯特菌、25株非单核李斯特菌、92株非李斯特菌验证该方法特异性.用添加了不同剂量的单增李斯特死菌、活菌及金黄色葡萄球菌的15件饮料,15件熟肉制品进行模拟实样检测.结果 单增李斯特活菌EMA实时荧光PCR方法的Ct=(38.46-3.30)×log(菌量)(R2 =0.999).低检测的活菌浓度为55 cfu/反应.对死菌DNA抑制效率≥99.98％.35株单增李斯特菌Ct值低16.21,高29.38,而25株非单单增李斯特菌、92株非单增李斯特菌的Ct值均大于35或无Ct值.重复试验Ct值变异系数小于5％.30件模拟实样单增李斯特菌的检测结果与常规方法完全一致.且EMA实时荧光PCR方法检出时间仅需10h左右,而常规分离培养方法需要5～7 d.结论 EMA实时荧光PCR检测技术是一种快速、简便、特异性强、灵敏度高、仅检测单增李斯特菌活菌的有效方法,可作为食品中检测单增李斯特活菌的方法推广使用.
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一种改良的布鲁氏菌病抗体微量凝集检测方法的建立与评价
目的 建立一种微量的布鲁氏菌病抗体凝集检测方法,用于布鲁氏菌病高通量检测.方法 依据我国《布鲁氏菌病诊断标准》(WS269-2007)规定的病人诊断标准,用试管凝集试验做诊断标准.通过优化微量凝集试验抗原浓度,对142份疑似病人血清同时做试管凝集和微量凝集试验,进行效果评价.结果 优的微量凝集抗原浓度为1∶10,建立微量凝集法具有较高的敏感度和特异度,分别为98.9％和92.3％;和常规试管凝集法相比,两种方法符合率为96.5％.常规试管凝集检测得到21份阴性样本,22份可疑样本(1∶50),99份阳性样本(＞1∶100).微量凝集检测得到30份阴性样本、17份可疑样本(1∶ 50)、95份阳性样本(＞1∶100).两种试验方法,结果相同的占70.4％(100/142),经统计学检验差异无统计学意义(x2=0.8,P＞0.05).结论 建立一种可显色的布鲁氏菌病抗体微量凝集检测方法,可以在96孔V型板上同时检测24份标本,且结果易判读,更适宜基层防疫人员现场检测,终为疫情处置提供强有力的技术支持.
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2016年福建省单核细胞增生李斯特菌临床病例及食品来源菌株的分子特征分析
目的 研究福建省单核细胞增生李斯特菌感染病例的临床特征及分离菌株的分子型别,为食源性疾病溯源和防控提供参考依据.方法 通过监测网报告的感染病例进行个案访谈调查;对2016年临床病例和即食食品来源的单核细胞增生李斯特菌分离株进行血清分型和PFGE分子分型.结果 感染病例均为免疫力低下的孕妇和新生儿,3株病例分离株血清型为2株1/2a和1株4b.8株食品分离株血清型为5株1/2a、2株4b和1株1/2b.11株PFGE分为10个型别.结论 2016年福建存在散发的单核细胞增生李斯特菌病例,PT型各异,无同源性.应加强监测、流行病学调查和饮食卫生宣教,保护孕妇和新生儿等高危人群.
关键词： 单核细胞增生李斯特菌 临床特征 血清分型 PFGE -
2009-2017年江苏省手足口病病原谱及柯萨奇A16型的分子流行病学研究
目的 描述2009-2017年江苏省手足口病(HFMD)病原谱及柯萨奇A16型(CVA16)的流行病学、基因变异及遗传进化特征.方法 对2009-2017年江苏省手足口病发病资料和病原学检测情况进行统计分析,选取120株CVA16病毒分离株进行VP1区全长基因序列测定,并对核苷酸及氨基酸序列进行同源性比较及系统进化分析.结果 2009-2017年江苏省共报告手足口病1 013 771例.其中,手足口病肠道病毒阳性病例37 389例,主要病原构成为EV71(39.85％)和CVA16(30.13％);重症病例中,以EV71为主要病原,CVA16及其他肠道病毒引起的重症病例较少.CVA16在每年的3～7月和9～11月出现流行高峰,主要感染1～4岁年龄段儿童,男性比例高于女性.江苏省地区流行的CVA16毒株属于B1a亚型和B1b亚型,其中B1b亚型为优势流行基因亚型.120株CVA16病毒分离株VP1区核苷酸及编码氨基酸序列同源性分别为87.5％～100％、97％～100％.结论 2009-2017年,江苏省地区流行的CVA16具有明显的时间、人群分布特征;120株CVA16分离株属于B1a亚型和B1b亚型.CVA16分离株核苷酸序列变异较大,但氨基酸同源性较高,推断存在一定的同义突变.
关键词： 手足口病 柯萨奇病毒A组16型 流行病学 遗传特征 -
山羊Th1/Th2细胞因子实时荧光定量检测方法的建立
目的 在mRNA水平对山羊Th1/Th2型细胞因子进行定量分析,建立山羊Th1/Th2型细胞因子实时荧光定量检测方法.方法 根据GenBank山羊Th1(IL-2和IFN-γ)和Th2 (IL-4、IL-6和IL-10)细胞因子基因保守序列设计引物,以标准阳性质粒为模板分别进行荧光定量PCR反应的标准曲线、溶解曲线建立.结果 山羊Th1/Th2细胞因子实时荧光定量检测方法Ct值与标准品呈良好的线性关系,R2均大于0.985,所有稀释度标准品模板出现特异性熔解蜂;利用N1蛋白缺失的重组山羊痘病毒(△N1L株)与山羊痘AV41株感染山羊外周血淋巴细胞进行IL-4和IFN-γ mRNA表达水平检测,△N1L株与山羊痘AV41株均能能够刺激机体IL-4和IFN-γ细胞因子,但二者差异无统计学意义(t=3.333,P＞0.5).结论 本研究建立山羊Th1/Th2细胞因子实时荧光定量检测,为山羊痘基因工程疫苗的研究奠定基础.
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Sigma E基因对耻垢分枝杆菌五种药物敏感性的影响及机制研究
目的 探讨Sigma E(sigma factor E,SigE)基因影响耻垢分枝杆菌对5种药物的敏感性及其作用机制研究.方法 PCR法扩增出耻垢分枝杆菌sigE基因,克隆入质粒pMV261构建重组pMV261-SigE质粒,测序验证.重组质粒电转入耻垢分枝杆菌,Western blot检测SigE的表达.设立含空质粒转化菌为对照组,采用刃天青作为指示剂的微量滴定板法和菌落计数法检测pMV2 61-SigE重组耻垢分枝杆菌对异烟肼、利福平、乙胺丁醇、左氧氟沙星和环丙沙星5种抗结核药物的敏感性.采用相应抗生素处理重组耻垢分枝杆菌48 h诱导细菌进入非复制持留状态,随后在含20 ng/mL的结核分枝杆菌复苏促进因子E(resuscitation-promoting factor E,RpfE)的7H9中静置培养2周,计数大可能数和细菌生长数,测算复苏指数来了解SigE对药物敏感性的影响机制.结果 成功构建pMV261-SigE,经测序鉴定序列正确,Western blot检测到SigE在耻垢分枝杆菌中表达.与对照组相比,表达SigE重组耻垢分枝杆菌组对异烟肼、利福平等5种药物的相对荧光百分比高,敏感性下降.5组抗生素中,异烟肼、乙胺丁醇两种药物作用后pMV2 61-SigE重组耻垢分枝杆菌复苏指数明显高于对照组.结论 SigE可通过促进耻垢分枝杆菌进入持留状态影响异烟肼和乙胺丁醇作用的敏感性.
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1981-2016年辽宁省肾综合征出血热特征分析
目的 探索辽宁省肾综合征出血热(HFRS)发病规律及流行趋势,为制定预防措施提供科学依据.方法 采用回顾性方法,收集1981-2016年辽宁省HFRS疫情数据和人口资料,分析HFRS时间、地区、人群发病的变化情况.结果 1981-2016年,辽宁省HFRS发病率波动在0.86/10万～13.04/10万之间,年平均发病率为4.16/10万,年平均死亡率为0.06/10万,平均病死率为1.52％.36年间出现了3个明显的发病周期(1981-1990年,1991-2009年,2010-2016年),第3个发病周期发病率波动较小,在1.67/10万～3.00/10万之间.HFRS秋冬峰(10-12月)和春夏峰(3-6月)发病例数的比值在1981-1998年维持在一个较高水平,高比值达14,1999-2016年秋冬峰与春夏峰发病例数的比值小于1.80年代初,疫区主要分布在辽宁省东部和中部,之后逐渐向西部和南部扩散.进入21世纪后,疫区扩大至全省2/3以上的县区,现主要集中在西部地区的葫芦岛、锦州以及东部地区的铁岭、抚顺地区.在人群分布上男性多于女性,以农民为主,15-64岁年龄组发病率高.结论 1981-2016年,辽宁省HFRS发病率经过2个较大发病周期后,逐渐降低至3/10万,流行季节性在90年代后期发生转变,秋冬峰与春夏峰发病人数比例发生逆转,疫区逐渐扩大,推断疫区类型由姬鼠型混合疫区向家鼠型混合疫区演变.
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弓形虫沉默信号调节子2(TgSir2)的克隆表达与多克隆抗体制备
目的 制备特异识别弓形虫沉默信号调节子2 (TgSir2)多克隆抗体.方法 以酵母Sir2氨基酸序列为模板,寻找弓形虫基因组中同源序列,并进行信号肽预测.以弓形虫RH株cDNA为模板,构建pET28b-TgSir2重组质粒,转化入大肠埃希菌(E.coli) BL21,经异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达后,用镍柱亲和层析法纯化诱导表达产物,并以小鼠抗His标签单克隆抗体作为一抗,蛋白质印迹(Western blotting)进行鉴定.以纯化的TgSir2蛋白作为抗原免疫新西兰大白兔,获得特异性抗TgSir2多克隆抗体.后,以此多克隆抗体作为一抗,Western blotting检测与虫体蛋白的反应情况.结果 同源比对找到弓形虫基因组中TgSir2,信号肽分析提示1-15位氨基酸为其信号肽序列.PCR、双酶切及测序结果证实原核表达质粒构建成功.SDS-PAGE结果表明,IPTG可诱导TgSir2融合蛋白的大量表达.Western blotting结果显示,制备的多克隆抗体既能特异性识别原核表达的TgSir2蛋白,也能识别弓形虫体内的内源性TgSir2蛋白.结论 制备的抗重组TgSir2蛋白多克隆抗体能特异性识别弓形虫RH株的TgSir2蛋白.
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南方部分农村地区人群蓝氏贾第鞭毛虫疾病负担研究
目的 了解我国南方部分地区人群蓝氏贾第鞭毛虫疾病负担.方法 采用多阶段随机抽样方法分别从我国湖北和广西某市各抽取约2000人作为调查对象,同时收集乡镇和县市级医院2014年10-12月门诊腹泻患者.利用碘液染色法检测粪便中贾第虫包囊,通过问卷调查收集调查对象一般人口学资料、就诊情况和疾病的社会经济影响等信息.结果 一般人群和腹泻患者贾第虫感染率分别为1.72％(69/4015)和5.17％(20/387);按照地区、年龄、性别分组后的不同人群贾第虫感染率差别均无统计学意义(P＞0.05).贾第虫在湖北和广西地区DALYs分别为0.04029/千人和0.02783/千人.门诊腹泻患者中贾第虫感染者每次人均经济负担为140.81元,主要为直接经济负担.结论 反映流行病学负担的贾第虫感染率和DALYs总体较低,但贾第虫病疾病经济负担较高,疾病防控应该在重点人群,预防为主,降低疾病负担.
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华支睾吸虫生活史室内微生态建立
目的 构建华支睾吸虫生活史的室内微小生态环境.方法 麦穗鱼饲养池120 cm×60 cm×50 cm,隔成3个区间,纹沼螺饲养盆66 cm×40 cm×18 cm,底部铺塘泥,种植水韭草,24 h充氧和抽水循环,12h光照,每2周换水1/2;将华支睾吸虫虫卵和纹沼螺一起放入平皿内感染8h,螺与虫卵比例约1∶50,每周重复1次,连续3次;将收集的尾蚴与麦穗鱼一起放入大烧杯进行尾蚴感染,加水1 000 mL,充氧过夜.结果 纹沼螺和麦穗鱼均能在饲养池内正常生长与繁殖;纹沼螺感染率约4.9％,麦穗鱼形成的囊蚴数与用于感染的尾蚴数之比约30.65％.结论 室内微型华支睾吸虫生活史生态环境构建成功.
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福建省2015年本地登革热病例的病原学特征
目的 分析2015年福建省本地登革热病例部分登革病毒流行株的基因组序列,调查相关病毒株之间的遗传联系,为福建省登革热防控提供病原学证据.方法 采集急性期患者血清,实时荧光RT-PCR检测登革病毒RNA,阳性者分离病毒,扩增病毒基因组并测序,以病毒全长编码区序列进行种系发生分析.结果 2015年福建省先后出现登革1型(DENV1)和登革2型病毒(DENV2)引起的本地暴发疫情,共发生4起聚集性病例,报告41例.分离到DENV1毒株9株,DENV2毒株8株.种系发生分析显示,9株DENV1高度相似,同属于基因1型(G1),提示其共同的输入来源可能为斯里兰卡;而8株DENV2病毒虽然同属于大都市基因型,却分为差异较大的两簇,表明莆田与福州两地疫情相关毒株的遗传关联度较低,可能分别来自马来西亚和印度.结论 2015年共出现4起聚集性本地登革热疫情,部分患者病毒分离株的病原学特征表明,福建省2015年本地登革热暴发疫情存在多个输入来源.
