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农贸市场中蜚蠊携带单增李斯特菌的调查及菌株特征分析
目的 初步探索农贸市场中蜚蠊李斯特菌的携带情况及农贸市场中食品李斯特菌污染的危险因素.方法 2015年10-12月从北京市某肉类(猪肉、羊肉、鸡肉)和水产品销售市场共采集147份蜚蠊样本进行李斯特菌的分离鉴定,并对分离到的单增李斯特菌进行血清型(serotyping)、脉冲场凝胶电泳(PFGE)分型以及多位点序列分型(MLST)分析.结果 蜚蠊样本中李斯特菌的分离率为58.06％ (78/147),包括单增李斯特菌、英诺克李斯特菌、威尔李斯特菌,其中,单增李斯特菌的分离率为17.68％(26/147),以水产品销售区域蜚蠊中分离率高(18.18％).血清型分析将26株单增李斯特菌分为4种血清型,分别为1/2c、1/2a、3a和1/2b,优势的血清型为1/b(34.60％)和1/2c (34.60％);PFGE分析将26株单增李斯特菌分为11种PFGE带型,优势的PT型为PT16(19.23％)和PT30(19.23％).MLST分析将26株单增李斯特菌分为5种序列型,分别为ST87、ST9、ST121、ST155、ST35,优势的序列型为ST87(34.62％).结论 农贸市场中蜚蠊能携带李斯特菌且不同食品销售市场中蜚蠊所携带的单增李斯特菌的分子型别不同,可能与不同食品类型携带的单增李斯特菌的型别不同而蜚蠊与食品间有交叉污染有关,因此蜚蠊可能成为农贸市场中传播单增李斯特菌并污染食品的危险因素之一.
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单增李斯特菌1/2c血清型菌株生物膜相关基因分析及耐药性研究
目的 了解单增李斯特菌1/2c血清型菌株与其他血清型菌株的生物膜相关基因和抗生素耐药性是否有差异.方法 采用聚合酶链反应技术对19个生物膜相关基因全长扩增测序分析,并与参考菌株EGD-e序列进行比对确定基因变异情况;根据K-B纸片法对选取的实验菌株进行药敏实验.结果 氨基酸序列比对发现1/2c血清型菌株的flaA基因编码的氨基酸在141位点发生突变,其他血清型菌株则没有,1/2c血清型菌株在prfA基因编码的89氨基酸位点、luxS基因编码的112和140氨基酸位点都不发生突变,其他血清型菌株则发生突变.78.43％的1/2c血清型菌株对头孢西丁中度敏感,对氨苄西林、米诺环素、利福平和呋喃妥因有不同程度的耐药.结论 不同血清型单增李斯特菌的flaA、luxS、prfA3个基因编码的氨基酸在某些位点突变有一定的规律性;1/2c血清型单增李斯特菌对某些抗生素呈现不同程度的耐药.
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一起单增李斯特菌引起新生儿败血症的溯源研究
目的 调查自贡市1例单核细胞增生性李斯特菌所引起的新生儿败血症病原学及流行病学特征,为防控提供参考.方法 检测新生儿血液样本、产妇阴道及外阴拭子样本中的单增李斯特菌,采集该新生儿家庭住所的食品及环境样本、住所附近农贸市场的食品样本,检测样本中的单增李斯特菌,同时对产妇进行问卷调查;对分离到的单增李斯特菌进行血清型鉴定,并运用多位点序列分型(MLST),脉冲场凝胶电泳(PFGE)技术研究菌株的同源性.结果 从新生儿及其母亲样品中分离到7株单增李斯特菌、居住地附近的农贸市场凉拌熟食摊中分离到1株,8株菌株的血清型均为1/2b,ST型均为ST87型,PFGE带型相似度100％.感染母亲与市场中污染凉拌熟肉的单增李斯特菌来自同一污染源,新生儿李斯特菌感染由母婴垂直传播导致.结论 凉拌熟肉制品很可能是孕产妇单增李斯特菌感染的危险因素,需要在食品安全风险监测项目中重点监测.围产期妇女单增李斯特菌感染的筛查应作为产妇产检的重要内容.
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北京市昌平区食源性单增李斯特菌特征分析
目的 了解北京市昌平区食源性单增李斯特菌(Lm)的毒力基因携带情况、抗生素敏感性及分子特征.方法 对2010-2016年12类食品中分离的22株Lm进行血清型、毒力基因、抗生素敏感性、多位点序列分型(MLST)和脉冲场凝胶电泳(PFGE)分析.结果 22株Lm分为5种血清型(以1/2c、3a血清型为主);19种毒力基因携带谱(T1～ T19),毒力基因阳性数为6～12个;对氨苄西林、青霉素、美罗培南、复方新诺明、万古霉素和环丙沙星敏感,出现对四环素、红霉素耐药菌株;分为8个序列型(ST)(包括7个新型STA1～STA7),STA3为主要型别;分为17种PFGE带型,其相似系数为63.5％～ 100.0％,PTI为主要PFGE带型.结论 昌平区食源性Lm以1/2c、3a血清型为主,STA3为主要型别,PTI为主要PFGE带型,其毒力基因的携带具有差异性,出现对四环素、红霉素耐药株,为食源性Lm的研究提供了参考.
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模拟粪便标本单增李斯特菌和伊氏李斯特菌TaqMan 双重实时荧光定量-聚合酶链反应检测方法
目的 建立一种TaqMan双重实时荧光定量-聚合酶链反应(real-time PCR),用于模拟粪便标本中单增李斯特菌和伊氏李斯特菌的快速检测.方法 以单增李斯特菌特异基因hly和伊氏李斯特菌特异基因smcL作为靶基因,合成2对引物和其相应的荧光探针,制作标准曲线,建立从模拟粪便标本中直接检测单增李斯特菌和伊氏李斯特菌的TaqMan双重real-time PCR.利用李斯特菌属中其他种李斯特菌及常见致病菌验证引物、探针的特异性;通过制备模拟粪便标本并对其进行二次增菌后,分别提取DNA,采用TaqMan双重real-time PCR进行检测,以达到快速检测单增李斯特菌和伊氏李斯特菌的目的.结果 采用本研究建立的TaqMan双重real-time PCR对模拟粪便标本的检测结果显示特异性良好,与其他种李斯特菌和其他病原菌均无交叉反应.模拟粪便标本中单增李斯特菌和伊氏李斯特菌的检测下限分别为2.45×103 cfu/g和2.92×103 cfu/g;模拟粪便标本在3h内可得出检测结果,当模拟粪便标本中单增李斯特菌含量为6 cfu/g和伊氏李斯特菌含量为5 cfu/g时,经过增菌后使用双重real-time PCR可检测出阳性结果.结论 本研究建立了以单增李斯特菌的特异基因hly和伊氏李斯特菌的特异基因smcL为靶基因的TaqMan双重real-time PCR检测方法,该方法具有特异性好、敏感性高、快速易操作等优点,可用于临床、食品及环境标本的快速诊断,以及我国人群中单增李斯特菌和伊氏李斯特菌的携带或感染状况的调查分析.
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模拟粪便标本中的单增李斯特菌的分离和检测
目的 建立针对粪便标本中单增李斯特菌的分离鉴定方法,评价方法的检测下限,以提高感染人群标本中单增李斯特菌的检出率,了解我国人群中该菌的携带及感染情况.方法 对模拟人粪便标本进行二次增菌,采用Real-time PCR检测,并同时分离培养获得该病原菌.结果 当每克模拟粪便标本中含有7 cfu的单增李斯特菌时,经过增菌后的标本用Real-time PCR方法可检测出阳性结果,并能够通过单增李斯特菌的选择培养基分离得到病原菌.结论 本研究为从粪便标本中分离单增李斯特菌和由单增李斯特菌引起的食物中毒事件的病原学调查提供了技术支持,有利于对我国人群中单增李斯特菌的携带或感染状况进行调查分析.
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2007-2011年北京市通州区分离单增李斯特菌的生物学及分子流行病学特征
目的 了解2007 -2011年北京市通州地区食品及患者分离的单增李斯特菌的生物学和流行病学特征,为李斯特菌病的预防控制提供参考依据.方法 对分离的单增李斯特菌进行6个毒力因子(prfA、actA、iap、hly、plcB、inlA)的检测、血清分型和脉冲场凝胶电泳分型.结果 57株单增李斯特菌的6个毒力因子均为阳性,分为5种血清型,主要血清型为1/2a和1/2c型,PFGE分型分为19种带型,主要带型为GX6A16.CN0004.结论 通州地区分离的单增李斯特菌全部携带6个主要毒力因子,分子型别呈现多态性.
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单增李斯特菌1/2c血清型菌株生物膜形成能力的研究
目的 比较在不同压力条件下,单增李斯特菌1/2c血清型与其他血清型菌株生物膜形成能力,以了解单增李斯特菌1/2c血清型菌株的环境适应能力.方法 采用96孔培养板结晶紫染色法,检测不同温度、不同培养基、不同pH值条件下,单增李斯特菌1/2c血清型与其他血清型菌株的生物膜形成能力.结果 在25℃、TSB、10％TSB和pH 7～8条件下,1/2c血清型菌株生物膜形成能力强于其他血清型菌株(P＜0.05).结论 在室温、富营养/低营养条件、中性略偏碱性环境中单增李斯特菌1/2c血清型菌株的生物膜形成能力强于其他血清型菌株,提示可能是食源性单增李斯特菌1/2 c血清型菌株分离率较高的原因之一,为该菌的预防控制措施提供了参考依据.
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中国部分食品来源单增李斯特菌中致病相关基因的分布研究
目的 了解中国食品来源部分单增李斯特菌(Listeria monocytogences,LM)中致病相关基因的分布情况.方法 383株LM分离自2002-2011年中国14省(市)的生肉、熟食、蔬菜、冷饮、水产等食品.采用PCR(polymerase chain reaction)和DNA打点杂交方法在单增李斯特菌中进行了55个致病相关基因的检测.结果 50个致病相关基因检出率均为100％,inlF、fbpA和mprF基因检出率为99.73％,aut基因检出率为99.22％(380/383),vip基因检出率为98.17％(376/383).结论 383株食品来源单增李斯特菌中,大部分致病相关基因均存在,部分毒力基因的缺失存在多样性.
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中国部分食品分离单增李斯特菌的抗菌药物敏感性及耐药基因检测
目的 了解我国部分食品中分离单增李斯特菌的抗菌药物敏感性和耐药性,探讨单增李斯特菌耐药基因的携带与耐药表型的关系.方法 采用微量肉汤稀释法对2005-2011年从我国7个省市/地区食品分离的203株单增李斯特菌进行庆大霉素、氨苄西林、头孢噻吩、青霉素、四环素、强力霉素、亚胺培南、红霉素、环丙沙星、左氧氟沙星、利福平、万古霉素、氯霉素、氨苄西林/舒巴坦、复方新诺明、诺氟沙星、头孢呋肟、多粘菌素B、呋喃妥因、氯林可霉素共20种抗菌药物药敏试验,采用PCR方法对实验菌株进行9种耐药基因及接合型转座子Tn916检测,并对阳性基因产物进行序列测定分析.结果 食源性单增李斯特菌对多粘菌素B、呋喃妥因、头孢呋肟、氯林可霉素、四环素、强力霉素、环丙沙星、诺氟沙星和氯霉素的耐药率分别为98.52％、55.66％、50.25％、12.81％、2.46％、1.97％、0.99％、0.99％和0.49％.203株单增李斯特菌中,5株对四环素耐药的菌株均检测出tetM基因,其中3株菌的tetM基因位于接合型转座子Tn916上.结论 食品中分离的单增李斯特菌存在不同程度的耐药情况,并有83株多重耐药株存在,具有引起食源性单增李斯特菌感染的风险存在,应加强对抗生素使用的管理以保证食品安全及公众健康.
关键词： 单增李斯特菌 微量肉汤稀释法 接合型转座子Tn916 -
多重实时荧光PCR快速检测沙门菌和单增李斯特菌
目的 建立可同时检测沙门菌、单增李斯特菌的双重实时荧光PCR快速检测方法,并应用于食品样品的检测.方法 根据GenBank上下载的沙门菌invA基因、单增李斯特菌hlyA基因的保守区序列分别设计特异性引物和TaqMan探针,建立并优化双重实时荧光PCR反应体系.对该方法的特异性、敏感性和稳定性进行评估,并应用于食品标本的检测.结果 实验结果表明,该检测方法特异性强,对大肠埃希菌、志贺菌、副溶血性弧菌等其他病原菌进行检测均未产生交叉反应.对沙门菌和单增李斯特菌纯培养物的低检出限分别可达10 cfu/ml和100cfu/ml;并且重复性好,变异系数均小于5%;对80份食品标本同时采用本文建立的双重荧光PCR方法和单重荧光PCR方法以及传统的分离培养方法进行检测,结果显示本文建立的双重荧光PCR方法对两种病原菌的检测效果明显优于单重荧光PCR方法以及传统的分离培养法,整个检测过程可在10 h内完成,包括前增菌所用的6 h.结论 本研究建立的多重实时荧光PCR方法能同时对沙门菌和单增李斯特菌进行快速检测,并且灵敏度高、特异性好,可为食源性疾病的病原学快速检测提供新的手段.
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单增李斯特菌、副溶血弧菌和沙门氏菌液相芯片检测方法的建立
目的 是建立一种快速检测单增李斯特菌、副溶血弧菌和沙门氏菌的液相芯片检测方法.采用基于间接竞争法的原理,将3种细菌抗原分别与不同的聚苯乙烯微球偶联,以藻红蛋白(PE)荧光标记二抗为信号,优化反应条件,对建立的方法进行灵敏度、特异性和可重复性验证.结果显示,3种细菌检测抗体佳加入量分别为10ng、10ng、5ng,建立的方法检测单增李斯特菌、副溶血弧菌和沙门氏菌的低检测限均可达到103 CFU/mL,检测其他常见食源性致病菌无交叉反应.结论表明,建立了一种快速检测食品中金黄色葡萄球菌的液相芯片检测方法,能够应用于实际样品的检测.
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食源性致病菌检测技术研究
近年来，全球范围内食品安全事件时有发生，2008年美国“沙门氏菌”疫情大爆发，2011年美国甜瓜“单增李斯特菌”污染事件，2014年新西兰恒天然乳品“肉毒杆菌”污染事件等。我国疾病预防控制中心相关资料表明，我国近年来由食源性致病菌引起的食品安全事件为严重，因此预防和控制由食源性致病菌污染引发的食品安全事件成为全球面临的共同挑战。研究和建立食源性致病菌快速检测方法，成为应对突发食品安全公共事件的关键手段。本文对现行的食源性致病菌检测技术现状及未来发展方向进行了总结与分析。
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如何实现快速检测及有效控制沙门氏菌
食源性疾病的治病因子主要有细菌、生物毒素、病毒、化学物质、寄生虫等5类，致病菌及其毒素，如沙门氏菌、单增李斯特菌、大肠杆菌O157、金黄色葡萄球菌等，在食源性疾病中，由致病菌引起的食物中毒是食品安全的主要问题，这些致病菌主要导致肠道疾病，严重的造成肝脏、大脑、肾脏等器官的损害，甚至死亡。本文主要介绍了沙门氏菌快速检测系统及有效控制的方案。
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单增李斯特菌PCR-ELISA快速检测技术研究
目的 建立快速检测单增李斯特菌的PCR-ELISA方法,将其应用于人工污染的食物样品检测.方法 根据GenBank数据库资料,应用分子生物学软件DNAMAN 6.0和Primer Premier 5.0,以单增李斯特菌的致病基因hlyA为基础,选用PCR引物,应用地高辛标记试剂盒,获得单增李斯特菌特异的地高辛标记片段.根据.PCR目的 片段序列,设计特异性捕获探针,建立了单增李斯特菌PCR-ELIA快速检测方法.应用该方法对不同血清型的单增李斯特菌食品分离株进行了检测,并将PCR方法与PCR-ELISA方法对人工污染单增李斯特菌的牛奶样品的检测敏感性进行了比较.结果 应用单增李斯特菌特异的PCR-ELISA方法完成检测约需6h.该方法对单增李斯特菌分离株检测的结果,与国家食源性疾病检测网的鉴定结果100%符合.经过12h的增菌培养,PCR-ELISA方法低可从25ml样品中检出1CFU,检测敏感性为传统PCR方法的10-100倍.结论 建立了单增李斯特菌PCR-ELISA快速检测方法.该方法敏感性高、特异性强、可靠性好,对于提高食源性疾病预警、预测能力,增强检测的时效性和准确性,具有推广应用价值.
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奶液模拟标本中单增李斯特菌real-time PCR检测方法的建立
目的 建立了基于TaqMan探针的real-time PCR技术针对奶液模拟标本中单增李斯特菌的快速检测方法.方法 用单增李斯特菌hlyO基因的部分片段作为靶基因,制作标准曲线,定量检测奶液中的单增李斯特菌.结果 通过对不同李斯特菌及一些较为常见的致病菌的DNA进行扩增,只有单增李斯特菌能够产生扩增曲线,其余菌株均不产生扩增曲线.单增孛斯特菌的检测灵敏度可以达到9copies/反应体系.结论 该方法特异性好,灵敏度高,整个实验可在1.5h内完成,可用于食品中单增李斯特菌的快速检测和疫情暴发时的相关病原调查.
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DiversiLab系统单增李斯特氏菌分子分型评估
目的 用DiversiLab系统(DVL)对单增李斯特菌进行分子分型,评估其分型能力.方法 用DVL对食品中分离的24株单增李斯特菌进行分子分型,并与脉冲场凝胶电泳( PFGE)结果进行比较,探讨DVL的分群能力和分辨率.结果 DVL将24株单增李斯特菌分成9个群,菌株之间的相似度46.7％～99.7％,DVL的相似度明显高于PFGE；DVL将PFGE型别相同的单增李斯特菌分在同一个的群中,也将不同PFGE型别的单增李斯特菌分在不同的群,但同一群中的单增李斯特菌有不同的PFGE型.结论 DVL操作简便、快速,重复性好,但分辨率低于PFGE；对大量单增李斯特菌分型时,先用DVL筛选再用PFGE对分布在同一群中的单增李斯特菌进行分型,能快速明确单增李斯特菌之间的关系.
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四种食源性致病菌多重PCR检测方法的建立
目的 建立一种多重PCR检测方法同时检测食品中沙门菌、志贺菌、金黄色葡萄球菌和单增李斯特菌.方法 参考沙门菌侵袭蛋白A(invA)基因序列,志贺菌侵袭性质粒抗原(ipaH)基因序列,金黄色葡萄球菌引物设计参考耐热核酸酶(nuc)基因序列,单增李斯特菌引物设计参考溶血素蛋白(hly)基因序列设计引物,通过多重PCR对4种食源性致病菌的目的基因进行扩增,并对反应体系进行优化.结果 对15株目标菌和17株非目标菌的检测未出现假阳性和假阴性结果,产物分子量与预期一致;4种菌的检测灵敏度分别至少达到10pg/μ1;对产物的测序分析表明所得序列与目的基因序列吻合;对319份样品的检测结果显示,其中4份生鲜乳中检出金黄色葡萄球菌,1份生猪肉中检出沙门菌.结论 该方法具有良好的检测特异性,可供食源性致病菌的快速检测.
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2002～2004年衢州市食源性致病菌监测
为了解衢州市食品中食源性致病菌的污染状况,为制定食源性致病菌的预防措施提供依据.2002～2004年对衢州市市区菜市场、超市的食品进行了大肠杆菌O157:H7、沙门氏菌、单核细胞增生李斯特氏菌(以下简称单增李斯特菌)、金黄色葡萄球菌和副溶血性弧菌等五种致病菌的监测.现将结果报告如下.
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大庆市2016年冷冻饮品加工过程中单核细胞增生李斯特菌污染状况分析
目的:分析2016年大庆市冷冻饮品生产加工时单核细胞增生李斯特菌污染情况,为食源性疾病监测提供参考信息.方法:选取了本市某冷冻饮品生产企业,对其生产加工各环节进行了抽样,抽选16份食品样品,63份非食品样品,对单核细胞增生李斯特菌进行检测.结果:共有7株单增李斯特菌被检出,总检出率是8.86％;非食品样本中检出率是11.11％,环境检出率是14.29％、人员13.33％、工具50.00％,其他可疑处检出率50.00％;灌装区检出率是13.95％.结论:大庆市冷冻饮品企业生产加工过程中,单增李斯特菌的污染情况为灌装区比较严重,工具,和其他可疑处的检出率高,应加强消毒和监督,防止潜在风险出现.
