线粒体DNA氧化损伤热点的形成及其修复速率的比较
摘要： 本研究旨在探讨线粒体DNA氧化损伤热点的形成是否与该点DNA修复速率慢有关. BRL-3A 细胞暴露于50 mmol*L-1过氧化氢(H2O2) 30 min后, 分别于0, 1, 4及24 h收获细胞, 应用连接介导聚合酶链反应分析线粒体DNA氧化损伤热点的修复百分率并与线粒体DNA氧化损伤的总修复百分率比较, 通过狭缝印迹法, 比较了各时间点细胞内p53/线粒体DNA比率来验证其修复的可靠性. 结果表明：在4及24 h, 热点的修复速率分别为5.2%和42.1%. 而线粒体DNA的总修复百分率分别为76.9%和84.1%, 后者与前者相比, 其修复速率快1～14倍左右. 应用狭缝印迹发现各时间点细胞内p53/线粒体DNA比率无明显变化. 因此, 线粒体DNA氧化损伤热点的形成与其修复速率较慢有关. 狭缝印迹结果表明所观测的线粒体DNA的修复是可信的.
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BN大鼠和豚鼠评价双黄连注射液的过敏反应
目的 为摸索适合评价中药过敏反应的动物,采用BN大鼠和豚鼠评价双黄连注射液过敏的反应.方法 BN大鼠和豚鼠分为ip或iv临床等倍剂量组(分别为360及300 mg·kg-1)、iv临床2倍剂量组(分别为720及600 mg·kg-1).以双黄连注射液为致敏原,分别对2种动物进行致敏,隔日1次,共3次.同时设生理盐水对照组,观察各组过敏反应症状;采用ELISA法测量血清和组织中组胺含量,HE染色法光镜下观察肺组织和气管病理改变.结果 双黄连注射液可以造成BN大鼠及豚鼠发生过敏反应,过敏反应发生率BN大鼠组明显高于豚鼠组,分别为62.86%和36.11%.双黄连注射液可使BN大鼠和豚鼠血清、肺和气管中组胺含量均明显升高,与各相应的对照组比较均具有显著性差异,同时,从数据上看,BN大鼠各组的组胺释放率均高于豚鼠各组.结论 双黄连注射液可造成BN大鼠及豚鼠发生过敏反应.BN大鼠的敏感性可能高于豚鼠,但还需进一步研究.
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γ-羟丁酸钠对缺氧缺血后新生大鼠海马N-甲基-D-天冬氨酸受体2B亚基mRNA表达的影响
目的探讨γ-羟丁酸钠(GHB-Na)对缺氧缺血后脑损伤新生大鼠有无保护作用及N-甲基-D-天冬氨酸受体2B亚基(NR2B)与脑损伤的关系.方法180只7日龄SD乳大鼠,随机分为5组(每组36只),分别为假手术(Sham)对照组、生理盐水(NS)对照组、GHB-Na 50,100和200 mg·kg-1组.按Rice法制备缺氧缺血模型.Sham组仅分离颈总动脉,不结扎,不缺氧.GHB-Na组动物于缺氧缺血后立即腹腔注射GHB-Na.Sham组和NS组动物注射相同体积的生理盐水.以后每8 h一次.在术后2, 6, 12, 24 h, 3和7 d每组处死6只乳大鼠.应用逆转录-聚合酶链反应技术测定左侧海马组织中NR2B mRNA的表达,并进行半定量分析.结果与Sham组相比,NS组术后2 h,NR2B mRNA的表达明显减少(约20%); 在术后6,12,24 h和3 d, NR2B mRNA的表达没有明显变化; 术后7 d,NR2B mRNA的表达显著升高(约94%).与NS组相比, GHB-Na 100 mg·kg-1组在术后6,12,24 h, 3和7 d,NR2B mRNA的表达明显减少(分别减少约27%,45%,19%,31%和37%);而GHB-Na 50,200 mg·kg-1组的NR2B mRNA 在这些时间点虽然也较NS组有不同程度的减少,但差异多无显著意义.结论 GHB-Na能有效抑制新生大鼠缺氧缺血后海马NR2B mRNA的表达,特别是100 mg·kg-1组的抑制作用好于50和200 mg·kg-1组.
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新型黄芩苷金属离子配合物对Kv1.4和Cav3.2离子通道的影响
目的：探讨新型黄芩苷（BC）金属离子钴、铜和镍（Co2+，Cu2+和Ni2+）配合物（BMC）对Kv1.4和Cav3.2离子通道的影响。方法稳定转染法获得分别装载各种离子通道（hERG，Kv1.2，Kv1.3，Kv1.4， Kv1.5，Kv1.6，Kv1.7，Kv1.8，Kir1.1，Kir2.1，KCNQ和Cav3.2）的HEK293细胞或者CHO细胞，应用全细胞膜片钳技术检测BC及BMC（BC-Co，BC-Cu和BC-Ni）对各离子通道的影响。全细胞膜片钳法检测不同浓度BC-Co和BC-Cu对稳态表达Kv1.4和Cav3.2离子通道的细胞上离子通道电流变化的影响。结果获得了稳定表达各离子通道的CHO细胞或HEK293细胞模型。BMC对各离子通道均有一定影响，尤其对Kv1.4和Cav3.2的影响为明显。BC-Co，BC-Cu和BC-Ni（10μmol·L-1）对Kv1.4的抑制率分别为91%，76%和-10%，对Cav3.2的抑制率分别为43%，57%和-14%，表现为金属离子的类效关系。BC-Co对Kv1.4和Cav3.2的IC50分别为1.69和0.81μmol · L-1；BC-Cu对Kv1.4和Cav3.2的IC50分别为1.66和0.58μmol·L-1。结论 BC-Cu和BC-Co对Kv1.4和Cav3.2离子通道有浓度依赖性地明显影响。
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Cr(Ⅵ)对肝细胞线粒体ATP酶6和ATP酶8基因表达的影响以及与能量代谢障碍的关系
目的 探讨Cr(Ⅵ)对肝细胞线粒体ATP酶6和ATP酶8基因表达水平与能量代谢的影响及其相互联系.方法 用Cr(Ⅵ)2,8和32 μmol·L-1分别处理体外培养的人胚L-02肝细胞24 h后,用细胞总RNA提取试剂盒分离RNA,线粒体ATP酶6和ATP酶8 mRNA表达水平用逆转录-荧光定量聚合酶链反应(qRT-PCR)测定;细胞ATP含量、线粒体呼吸链复合体酶Ⅴ活性与细胞活性氧(ROS)含量分别用化学发光法、紫外分光光度法和荧光分光光度法检测.结果 与正常对照组相比,Cr(Ⅵ)2,8和32 μmol·L-1使ROS显著升高(P＜0.05);与正常对照组相比,Cr(Ⅵ)2μmol· L-1可使ATP酶6和ATP酶8基因表达水平增高(P＜0.05),Cr(Ⅵ)8和32μmol·L-1使之明显降低(P＜0.05);而呼吸链复合体酶Ⅴ活性及细胞内ATP含量均随Cr(Ⅵ)浓度的增加而显著降低(P＜0.05).ATP酶6和ATP酶8基因表达与呼吸链复合体酶Ⅴ活性及细胞内ATP含量呈正相关(r=0.858,0.795,0.809,0.766,P＜0.01),与ROS水平呈负相关(r=-0.738,-0.801,P＜0.01).结论 Cr(Ⅵ)能诱导肝细胞ATP酶6和ATP酶8基因表达水平改变,导致线粒体呼吸链复合体酶Ⅴ活性及细胞内ATP含量降低.
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肝纤维化状态下小肠药物代谢功能的改变
目的探讨肝纤维化时小肠药物代谢功能的变化,为合理用药提供依据.方法在大鼠肝纤维化模型上,测定小肠粘膜上皮细胞药物代谢酶、抗氧化酶及膜流动性变化,并与急性肝损伤、慢性肝硬化大鼠小肠相关指标进行比较.结果与正常对照组相比,肝纤维化大鼠小肠粘膜上皮细胞药物代谢Ⅰ相酶红霉素N-脱甲基酶(CYP3A)、7-乙氧异口恶唑O-脱乙基酶(CYP1A1)和苯胺羟化酶(CYP2E1)活性分别增加2.2,0.6和0.3倍,而Ⅱ相酶葡糖醛酸转移酶(UDPGT)和α-、π-谷胱甘肽S-转移酶(GST)活性则分别减少15%,43%和57%,同时膜脂质过氧化产物增加,抗氧化酶活性减弱,膜流动性降低.急性肝损伤时,上述指标无明显变化,而肝硬化时上述指标与肝纤维化组变化一致,并进一步增强.结论肝纤维化可影响小肠粘膜上皮细胞药物代谢功能,使Ⅰ相氧化功能增强,Ⅱ相结合反应减弱.小抗氧化功能降低可能与Ⅰ相氧化代谢增强有关.
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党参和甘草糖复合物对IEC-6细胞迁移和膜电位的影响
目的：观察党参糖复合物和甘草糖复合物对小肠上皮细胞IEC-6迁移和细胞膜电位的影响，探讨益气健脾中药党参和甘草促进胃肠黏膜损伤修复的作用机制。方法在正常或钾通道抑制剂4-氨基吡啶（4-AP）负荷下，分别加入党参和甘草糖复合物（25~200 mg·L-1）与IEC-6细胞培养24 h，相差显微镜下观察细胞迁移数，流式细胞仪检测细胞膜电位。结果与细胞正常对照组比较，党参和甘草糖复合物（50和100 mg·L-1）可提高细胞迁移数（P<0.01，P<0.05）。与正常对照组比较，4-AP可减少细胞迁移数（P<0.01）；与4-AP模型组比较，党参和甘草糖复合物（50~200 mg·L-1）可逆转4-AP所致的细胞迁移抑制（P<0.01）。流式细胞仪检测结果表明，与正常对照组比较，党参和甘草糖复合物（50 mg·L-1）可提高细胞膜电位（P<0.01），增加细胞膜超极化水平；与正常对照组比较，4-AP模型组细胞膜电位降低（P<0.01），增加细胞膜去极化水平；与4-AP模型组比较，党参和甘草糖复合物（100和200 mg·L-1）可逆转4-AP所致的细胞膜去极化（P<0.01）。结论党参和甘草促进胃肠黏膜损伤修复的作用机制，可能与其糖复合物影响小肠上皮细胞迁移的多胺介导钾通道激活信号通路有关。
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preS1-preS2-HBsAg真核表达载体的构建及在293细胞中的表达
目的 研究含有前S1抗原、前S2抗原的乙肝病毒外膜蛋白(前S1蛋白+前S2蛋白+S蛋白)的跨膜特性.方法 依据乙肝病毒大外膜蛋白的计算机模拟图将其分为分别命名为HBsAg1(1-174),HBsAg2(1-245),HBsAg3(1-294),HBsAg4(1-341),HBsAg5(1-373),HBsAg6(1-400),终累加成一条连续的长链状态,贯穿在细胞内外形成四次跨膜区,并以此6个片段为模板设计6对引物.从含有乙肝病毒外膜蛋白基因的质粒pcDNA3.1-preS1-preS2-HBsAg中扩增出前S1,S2基因,采用重叠延伸PCR方法连接人尿激酶原信号肽+6×组氨酸(His)+前S1蛋白、前S2蛋白+ HBsAg(1 ～6)+血细胞凝集素(HA);PCR产物经Xho Ⅰ和EcoR Ⅰ双酶切后插入经同样处理的真核表达载体pIRES2-EGFP,构建含有Pro-UK,6 × His,preS1,preS2,HBsAg跨膜序列及HA的表达载体pIRES2-EGFP/Pro-UK-6×His-preS1-preS2-HBsAg(1 ～6)-HA,该表达载体应能够共表达乙肝病毒外膜蛋白和绿色荧光蛋白.采用阳离子脂质体法将构建好的表达载体转染293细胞,经G418加压筛选阳性克隆,并进一步通过荧光观察、蛋白质免疫印迹、免疫双标等方法检测目的蛋白在293细胞的表达.结果 PCR结果显示,电泳片段大小符合HBsAg1～HBsAg6片段的600,810,957,1098,1194和1275 bp理论值.酶切鉴定正确的重组质粒测序结果与预期序列完全一致.转染和单克隆筛选后得到转染成功的HBsAg1 ～ HBsAg6的293细胞,呈亮绿色,细胞形态良好,荧光表达强度高;Western印迹结果显示,在相对分子质量31 000,34 000,44 000,47000,54 000和60 000处有明显的阶梯状蛋白信号,条带清晰并与理论值相一致.结论 成功构建了含有前S1、前S2蛋白的乙肝外膜蛋白基因的真核表达载体,并获得了能共表达乙肝外膜蛋白跨膜序列和绿色荧光蛋白的293细胞系.
关键词： 真核表达载体 pIRES2-EGFP 乙肝外膜蛋白 293细胞 -
普拉克索引起大鼠Y迷宫冲动样行为及机制
目的观察普拉克索（PPX）改变大鼠Y迷宫电击逃避任务的行为特点,并探讨其可能的作用机制。方法大鼠一次性sc给予PPX 0.1，1和10 mg·kg-1后，采用Noldus Etho Vision XT8影像行为轨迹分析系统检测大鼠Y迷宫电击逃避任务中判断正确反应次数、穿梭次数、运动距离和安全区停留时间的变化。通过大鼠震惊反射前脉冲抑制实验和清醒大鼠脑微透析实验，观察PPX对正常大鼠感觉运动门控系统以及对纹状体、杏仁核内单胺类神经递质含量的影响。结果与正常对照组对比，PPX组大鼠在Y迷宫判断正确反应次数上无显著性差异，但在一次逃避任务完成后、下一个任务开始前，迷宫内继续穿梭次数和运动距离显著增加（P<0.01），安全区停留时间明显减少（P<0.05），表现出类似强迫冲动的行为。震惊反射实验中，PPX组大鼠出现了前脉冲抑制受损的现象（P<0.01）。脑微透析结果显示，PPX对纹状体和杏仁核内多巴胺和5-羟色胺（5-HT）的浓度无明显影响。结论 PPX可能通过损害感觉门控系统而诱导大鼠表现出类似强迫-冲动的行为。
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胎儿发育时期肾上腺的抗氧化功能
目的了解胎儿发育期间肾上腺的抗氧化功能及其特征.方法差速离心法制备胎组织亚细胞组分,测定多种抗氧化酶活性,并进行相关性分析.结果肾上腺细胞胞浆内谷胱甘肽S-转移酶(GST)α、π和μ亚型活性分别是肝细胞浆的0.5倍、4.4倍和8.3倍,胎肾上腺和肝脏胞浆πGST活性皆随胎龄递减(r=-0.579;r=-0.632).微粒体和线粒体中也可检测到πGST和πGST.肾上腺中超氧化物歧化酶、谷胱甘肽过氧化物酶和谷胱甘肽还原酶活性分别为肝脏的2.1倍、1.8倍和5.0倍,而过氧化氢酶活性则明显低于肝脏.电镜下显示,8月龄胎肾上腺细胞核周粗面内质网及游离核糖体明显增多,可见多个溶酶体,次级溶酶体和吞噬小体.结论胎儿发育时期,肾上腺已具有较完善的抗氧化酶系统,其抗氧化能力不亚于肝脏.
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槲寄生总碱和多糖对黄曲霉菌毒素诱发大鼠肝癌前病变时血清同工酶含量的影响
目的 研究槲寄生提取物对黄曲霉毒素B1(AFB1)诱发大鼠肝癌前病变时同工酶含量的影响.方法 60只大鼠被分为正常对照组、单纯肝大部切除组、AFB1模型组、槲寄生总碱组和槲寄生多糖组.后3组大鼠一次性ip给予AFB1 0.75 mg·kg-1, 第3周起饲以含 0.015%二乙酰氨基芴饲料5周.后4组大鼠于第3周末施行肝大部切除术.槲寄生总碱和槲寄生多糖组于肝大部切除术后1周开始分别ig给予槲寄生总碱8 g·kg-1和槲寄生多糖6 g·kg-1,每天1次,连续给药4周.第8周末处死大鼠,采用组织化学染色法检测肝组织切片中γ-谷氨酰转肽酶(GGT)阳性染色面积;免疫吸附法测定血清GGT同工酶Ⅱ(GGTⅡ)阳性表达;酶速率法和琼脂糖电泳法测定血清乳酸脱氢酶(LDH)和碱性磷酸酶(ALP)总活性及其同工酶相对含量.结果 AFB1引起肝脏组织中GGT 表达明显增加;大鼠血清GGTⅡ阳性率明显升高;血清LDH总活性和LDH5含量增高,且LDH5＞LDH4;血清ALP1含量明显升高,并出现异常ALP电泳条带.大鼠ig给予槲寄生总碱或槲寄生多糖治疗4周,肝脏组织中GGT 表达明显减少,血清GGTⅡ阳性率明显下降,血清LDH总活力、LDH5和ALP1含量均较模型组明显降低.结论 AFB1 诱发的大鼠肝癌前病变有多种同工酶的表达异常,槲寄生总碱和多糖可能通过调节同工酶的表达干预肝癌前病变的发生和发展.
