高血压性肾损害
摘要： 临床上将高血压造成的肾脏结构和功能的改变,称为高血压性肾损害,主要为小动脉性肾硬化.高血压持续5～10年,即可引起肾脏小动脉硬化(弓状动脉及小叶间动脉肌内膜增厚、入球小动脉玻璃样变)、管壁增厚、管腔变窄,进而继发肾实质缺血性损害,包括肾小球缺血性皱缩、硬化,肾小管萎缩,肾间质炎细胞浸润及纤维化,导致良性小动脉性肾硬化症;而急进性高血压或恶性高血压所致的恶性小动脉性肾硬化症目前相对少见.
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褪黑素通过Toll样受体4信号通路抑制高糖诱导的小鼠系膜细胞增殖及炎性因子表达
目的 探讨褪黑素(MT)对高糖刺激小鼠系膜细胞(SV40)的增殖、Toll样受体4(TLR4)信号通路及炎性因子表达的影响.方法 分组:甘露醇对照组(30 mmol/L甘露醇),正常对照组(5 mmol/L葡萄糖),对照(5 mmol/L葡萄糖)+1000 μmol/L MT组,高糖组(25 mmol/L葡萄糖),高糖+10、100、1000 μmol/L MT组及高糖+TLR4抑制剂(TAK242)组.(1)利用CCK-8细胞毒性试剂盒检测细胞活力,EdU试剂盒测定细胞增殖.利用细胞免疫荧光观察TLR4的表达及核因子κB (NF-κB p65)的入核情况.(2)实时定量PCR检测TLR4 mRNA表达,实时定量PCR及ELISA法分别测定各组细胞下游炎性因子单核细胞趋化因子-1(MCP-1)、白细胞介素1β(IL-1β)、肿瘤坏死因子α(TNF-α)的mRNA和蛋白分泌水平;Western印迹检测TLR4通路蛋白TLR4、髓样分化因子88(MyD88)、β干扰素TIR结构域衔接蛋白(Trif)、磷酸化干扰素调节因子3(p-IRF3)和磷酸化NF-κB抑制蛋白(p-IκB)的表达.结果 高糖可刺激系膜细胞增殖,促进TLR4表达、NF-κB p65核转移,而MT和TLR4抑制剂均可抑制上述现象,且MT的抑制作用呈浓度依赖性.与正常对照组比较,高糖刺激不仅上调TLR4、MCP-1、IL-1β和TNF-αmRNA的表达(均P＜0.05),而且MyD88、Trif、p-IRF3、pI-κB的蛋白表达也明显增加(均P＜0.05).与高糖组比较,高糖+10、100、1000 μmol/LMT组及高糖+TAK242组TLR4表达下调的同时,MyD88、Trif、p-IRF3、pI-κB、MCP-1、IL-1β、TNF-α的表达也降低了(均P＜0.05),且MT的干预作用呈浓度依赖性.结论 高糖刺激增加了系膜细胞的增殖,MT可通过TLR4信号通路抑制高糖诱导的系膜细胞增殖和炎性因子表达.
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虫草菌液通过增强自噬改善β-甘油磷酸诱导的血管平滑肌细胞钙化
目的 探讨冬虫夏草提取物虫草菌液(Cordyceps sinensis,CS)对高磷诱导的血管平滑肌细胞钙化的影响机制.方法 用细胞增殖与活性检测试剂盒(cell counting kit-8,CCK-8)检测CS对细胞生存活力的影响;用β-甘油磷酸(β-GP,10 mmol/L))建立大鼠血管平滑肌细胞(VSMC)钙化模型,加入CS(10 mg/L)、自噬抑制剂3-甲基腺嘌呤(3-methyladenine,3-MA,5 mmol/L)及一磷酸腺苷(AMP)活化的蛋白激酶(AMPK)抑制剂化合物C(CC,10 μmol/L)进行干预,实验分为5组:对照组(Ctrl)、β-GP组、β-GP+CS组、3-MA+β-GP+CS组、CC+β-GP+CS组.通过茜素红S染色及钙测定试剂盒检测各组细胞钙沉积量;透射电镜观察VSMC内自噬体的形成;免疫荧光检测细胞质内微管相关蛋白1轻链3(LC3)的表达;Western印迹法检测血管平滑肌标志物α-SMA蛋白、成骨指标Runx2、自噬相关蛋白LC3Ⅱ/LC3Ⅰ和Beclin1及AMPK/雷帕霉素靶蛋白(mTOR)信号通路蛋白.结果 虫草菌液能使高磷环境中血管平滑肌细胞的自噬体、LC3荧光点状聚集及LC3Ⅱ/LC3Ⅰ、Beclin1、α-SMA、磷酸化(p)-AMPK蛋白表达增多,Runx2、p-mTOR蛋白表达及钙沉积减少(均P＜0.01).用3-MA抑制自噬后,β-GP+CS环境中的血管平滑肌细胞α-SMA蛋白表达减少(P＜0.01),Runx2蛋白表达及钙沉积增多(均P＜0.01),提示虫草菌液是通过激活自噬减轻了β-GP诱导的血管平滑肌细胞的钙化.用CC抑制AMPK/mTOR信号通路后,β-GP+CS组的血管平滑肌细胞的p-AMPK蛋白表达明显减少(P＜0.01),且LC3Ⅱ/LC3 Ⅰ、Beclin1、α-SMA蛋白表达量及自噬体、LC3荧光点状聚集也减少,p-mTOR、Runx2蛋白表达量及钙沉积增多(均P＜0.01),提示虫草菌液是通过激活依赖AMPK/mTOR信号通路的自噬而减轻了β-GP诱导的血管平滑肌细胞的钙化.结论 虫草菌液能有效减轻高磷诱导的血管平滑肌细胞钙化,其机制可能是通过激活AMPK/mTOR信号通路增强自噬.
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糖尿病和糖尿病肾病小鼠肾组织中长链非编码RNA的差异表达
目的 分析发生蛋白尿和不发生蛋白尿的db/db糖尿病(DM)小鼠肾组织中的长链非编码RNA(lncRNA)的差异表达,为探索糖尿病肾病(DN)的发病机制提供依据.方法 随机挑选周龄相同的小鼠正常(db/m小鼠)组、DM(db/db小鼠)组各3只,DN(db/db小鼠)组2只,采用Illumina高通量测序得到3组小鼠肾组织组间差异表达lncRNA、mRNA及各自表达丰度值(fragments per kilobase million,FPKM).通过lncRNA基因座位置等预测lncRNA的靶基因;通过GO、KEGG等数据库预测差异表达lncRNA的生物学功能.提取各小鼠肾组织的总RNA,使用实时定量PCR(RT-qPCR)筛选变化趋势与测序结果一致的lncRNA.结果 与DM组小鼠相比,DN组小鼠尿白蛋白肌酐比(UACR)、血肌酐、肾小球基底膜厚度均显著升高(均P＜ 0.05),而血糖差异无统计学意义(均P＞0.05);与DM组小鼠相比,DN组小鼠有160个lncRNA表达上调,99个lncRNA表达下调;筛选小鼠DM及DN组FPKM均≥2及组间差异表达倍数≥1的差异表达lncRNA,进行RT-qPCR验证,得到3个与测序结果一致的lncRNA.结论 DM和DN db/db小鼠肾组织中lncRNA表达存在显著差异,这种差异表达有可能参与了DN的发病.
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miRNA-148b靶向AMPKα1通过氧化应激介导高糖诱导的人肾小管上皮细胞凋亡
目的 探讨微小RNA-148b(miRNA-148b)在高糖诱导肾小管损伤中表达变化及其作用机制.方法 体外培养人肾小管上皮细胞(HK-2细胞),分为正常糖组、甘露醇高渗对照组、高糖组,培养48 h后,实时定量PCR法检测miRNA-148b表达;采用2',7'-二氯二氢荧光素二乙酸酯(DCFH-DA)在荧光显微镜下检测细胞内活性氧(ROS)水平;Western印迹检测HK-2细胞腺苷单磷酸活化蛋白激酶α1 (AMPKα1)、NOX2、NOX4、Bcl-2、cleaved-caspase3的蛋白表达.结果 培养48 h后,与正常糖组相比,高糖组、高渗组HK-2细胞内miRNA-148b表达上调(P＜0.01),ROS产生增多(P＜0.01),NOX2、NOX4蛋白表达增多(均P＜0.01),AMPKα1蛋白和抗凋亡蛋白Bcl-2蛋白表达减少(均P＜0.01),线粒体凋亡通路相关蛋白cleaved-caspase3蛋白表达增加(P＜0.01),差异均有统计学意义.结论 高糖上调体外培养HK-2细胞miRNA-148b的表达,靶向抑制AMPKα1的表达,促进NOX2、NOX4表达,活性氧产生增多,活化线粒体凋亡途径,激活caspase酶,诱导HK-2细胞凋亡.高糖的肾小管毒性部分是渗透压的影响.miRNA-148b可能参与了糖尿病肾病病理损伤的发生,有望成为糖尿病肾病新的治疗靶点.
关键词： 糖尿病肾病 氧化应激 肾小管上皮细胞 miRNA-148b AMPKα1 -
NOD2调控Snail表达在糖尿病肾病足细胞上皮-间质转分化中的作用
目的 观察高糖环境中足细胞核苷酸结合寡聚化结构域蛋白2(NOD2)、上皮-间质转分化(EMT)相关蛋白的表达,探讨NOD2参与EMT的分子机制.方法 常规方法培养人肾小球足细胞,高糖刺激后细胞免疫荧光法检测EMT相关蛋白α平滑肌肌动蛋白(α-SMA)、nephrin的表达;实时荧光定量PCR和Western印迹法检测NOD2、锌指转录因子(Snail)和足细胞EMT相关蛋白α-SMA、结蛋白(Desmin)、上皮型钙黏蛋白(E-cadherin)及Nephrin的表达.shRNA干扰NOD2表达后再给予高糖刺激细胞,Western印迹法检测Snail及后续EMT相关蛋白的表达情况.用shRNA干扰Snail表达后,胞壁酰二肽(MDP)活化NOD2,Western印迹法检测E-cadherin、Nephrin、Desmin、α-SMA的表达.结果 高糖刺激24 h后,与正常对照组相比,高糖组NOD2、Snail mRNA和蛋白的表达明显增加;上皮表型蛋白E-cadherin、Nephrin mRNA和蛋白的表达下调,间质表型蛋白Desmin、α-SMA mRNA和蛋白的表达上调(均P＜0.05);高渗对照组无明显变化.干扰NOD2表达后,Snail及EMT相关蛋白表达异常均得到恢复,与高糖组相比差异有统计学意义(均P＜ 0.05).与MDP组相比,MDP+shRNA-Snail组细胞E-cadherin、Nephrin蛋白的表达明显增加;Desmin、α-SMA表达明显减少(均P＜0.05).结论 高糖可诱导足细胞NOD2表达,并通过上调Snail表达促进足细胞上皮-间质转分化.以NOD2/Snail/EMT通路为靶点的基因干预可减轻高糖引起的足细胞损伤,可能为糖尿病肾病的治疗提供新思路.
关键词： Nod2信号接头蛋白质 细胞转分化 足细胞 锌指转录因子 -
高糖环境下肾小管上皮细胞来源外泌体诱导巨噬细胞激活的作用与机制
目的 探讨高糖环境下肾小管上皮细胞来源外泌体诱导巨噬细胞激活的作用与机制.方法 (1)正常糖(5.5 mmol/L)及高糖(30.0 mmol/L)分别处理人肾小管上皮细胞(HK2)48 h,收集两组上清液,使用超速离心法提取外泌体,采用透射电镜、Western印迹鉴定外泌体.(2)两组外泌体以PKH67标记后分别刺激人急性单核细胞白血病细胞株(THP-1)诱导分化的巨噬细胞,激光共聚焦观察THP-1巨噬细胞是否吞噬外泌体;显微镜下观察THP-1巨噬细胞的形态;Transwell小室法检测THP-1巨噬细胞的趋化能力;实时荧光定量PCR与酶联免疫吸附试验(ELISA)分别检测THP-1巨噬细胞的诱导型一氧化氮合酶(iNOS)、肿瘤坏死因子(TNF-α)、白细胞介素1β(IL-1β)、单核细胞趋化蛋白-1(MCP-1/CCL2)水平;Western印迹检测各组p-JNK、p-p38MAPK和NF-κB p65蛋白的水平.结果 (1)上清液经超速离心获取的囊泡,在电镜下观察到外泌体,粒径30～100 nm.Western印迹检测囊泡表达外泌体的标志蛋白CD63和TSG101,不表达Calnexin蛋白,提示所获取外泌体的纯度较高.(2)激光共聚焦证实各组外泌体均能被THP-1巨噬细胞吞噬.与正常糖外泌体刺激组相比,高糖外泌体刺激组的THP-1巨噬细胞趋化能力增强,iNOS、TNF-α、IL-1β、MCP-1的表达和分泌水平均上调(均P＜0.01),p-JNK、p-p38 MAPK和NF-κB p65蛋白水平也显著升高(均P＜ 0.01).结论 高糖环境下肾小管上皮细胞分泌的外泌体可通过MAPK/NF-κB信号通路诱导巨噬细胞的激活和功能改变.
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吡非尼酮在治疗糖尿病肾病小鼠肾纤维化中的作用及机制
目的 观察吡非尼酮对db/db小鼠糖尿病肾病模型的疗效,并探讨其作用的分子机制.方法 (1)以野生型小鼠为正常对照组,db/db小鼠分为模型组和吡非尼酮组,每组各6只.吡非尼酮组给予250 mg· kg-1·d-1吡非尼酮连续灌胃18周,其他两组以0.5％羧甲基纤维素钠灌胃.测定血糖、24h尿白蛋白量;PAS染色、PASM染色、Masson染色、天狼星红染色评估肾组织病理改变;免疫组化检测肾组织Ⅳ型胶原表达.(2)以小鼠肾小球系膜细胞(SV40MES-13细胞)为体外研究对象.细胞分为对照组、高渗组、高糖组,及50、100、200、400、800、1600 mg/L吡非尼酮+高糖组,BrdU细胞增殖检测评估细胞增殖率.细胞分为对照组、高渗组、高糖组和吡非尼酮+高糖组,实时荧光定量PCR检测α平滑肌肌动蛋白(α-SMA)、Ⅰ型胶原、Ⅳ型胶原、转化生长因子β1 (TGF-β1)、白细胞介素(IL)-1β、IL-6及单核细胞趋化蛋白1(MCP-1)mRNA的表达.结果 (1)与正常对照组比较,模型组小鼠体重增加,血糖升高,伴有大量蛋白尿,并出现肾小球肥大、系膜区扩张、小管间质纤维化等病理改变,肾组织Ⅳ型胶原合成增加(均P＜ 0.05).与模型组比较,吡非尼酮组db/db小鼠24h尿蛋白量降低,肾小球肥大、系膜区扩张及小管间质纤维化减轻,肾组织Ⅳ型胶原的表达减少(均P＜ 0.05).(2)与高糖组比较,100、200、400、800、1600 mg/L吡非尼酮+高糖组MES-13细胞增殖率均降低(均P＜0.05),400 mg/L吡非尼酮+高糖组α-SMA、Ⅰ型胶原、Ⅳ型胶原、TGF-β1、IL-1β、IL-6、MCP-1 mRNA表达均减少(均P＜ 0.05).结论 吡非尼酮可抑制小鼠肾小球系膜细胞增殖及活化,下调TGF-β1及促炎因子的表达,减少胶原的合成,从而改善db/db小鼠肾纤维化.
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磷酸钙晶体通过BMP-2/Smad信号通路促进血管钙化
目的 探讨高磷诱导的磷酸钙晶体是否通过BMP-2/Smad信号通路激活人主动脉平滑肌细胞(HASMCs)成骨转分化.方法 高磷培养基在37℃孵育3d,超速离心法分离磷酸钙晶体和上清液,扫描电镜和能量色散X射线光谱仪分析晶体理化特征.体外培养HASMCs,分为高磷组、对照组、晶体组和上清液组.茜素红染色和邻甲酚酞络合酮法测钙化结节和细胞内钙含量.Western印迹法测骨形态发生蛋白2(BMP-2)、转录因子RUNX2、骨桥蛋白(OPN)、磷酸Smad 1/5/9(p-Smad 1/5/9)蛋白表达.HASMCs分别进行BMP-2和Smad1基因敲减,Western印迹法测蛋白表达.结果 高磷培养基诱导磷酸钙晶体形成.与对照组相比,磷酸钙晶体促进HASMCs钙化结节形成,增加细胞内钙含量,上调BMP-2、RUNX2和OPN蛋白表达(均P＜ 0.05).磷酸钙晶体刺激HASMCs 30 min后,p-Smad 1/5/9蛋白水平达到峰值(P＜0.05).敲减BMP-2基因后,磷酸钙晶体刺激HASMCs后p-Smad1蛋白表达受抑,RUNX2和OPN蛋白表达降低(均P＜0.05).敲减Smad1基因后,磷酸钙晶体刺激HASMCs后RUNX2和OPN蛋白表达降低(均P＜0.05).结论 高磷诱导的磷酸钙晶体通过BMP-2/Smad信号通路促进HASMCs成骨转分化.
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WNK3激酶对肾脏大电导钙激活钾通道的调节作用及机制
目的 探讨WNK3激酶对肾脏大电导钙激活钾通道(Maxi K通道)的调节作用及其机制.方法 (1)在非洲绿猴肾成纤维细胞(Cos-7细胞)中转染0.5 μg Maxi K质粒的同时分别转染0、0.6、1.2、1.8 μg WNK3质粒,Western印迹检测细胞总蛋白中Maxi K通道的表达及丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)细胞外信号调节激酶1/2(ERK 1/2)的磷酸化水平.(2) Cos-7细胞分为转染2.5 μg Maxi K质粒组(对照组)和转染2.5 μg Maxi K质粒+2.5 μg WNK3质粒组(实验组),细胞表面生物素化方法检测细胞表面膜蛋白中Maxi K通道的表达,免疫沉淀和Western印迹检测Maxi K通道蛋白泛素化水平.(3)用WNK3 siRNA沉默WNK3激酶基因,用质子泵抑制剂(Baf-A1)阻断溶酶体降解途径,Cos-7细胞分为Maxi K+阴性对照siRNA组、MaxiK+WNK3 siRNA组和Maxi K+WNK3 siRNA+Baf-A1组.Western印迹检测细胞中Maxi K通道蛋白的表达.结果 (1)与0 μg WNK3质粒组比较,转染0.6、1.2、1.8 μg WNK3质粒组细胞总蛋白中Maxi K通道的表达均升高,MAPK ERK1/2的磷酸化水平均降低(均P＜0.01),且呈剂量依赖性.(2)与对照组比较,同时转染WNK3和Maxi K的实验组细胞总蛋白和膜蛋白中Maxi K通道的表达均增加,Maxi K通道蛋白的泛素化水平降低(均P＜0.01).(3)与Maxi K+阴性对照siRNA组比较,Maxi K+WNK3 siRNA组Maxi K蛋白表达降低(P＜0.01),Maxi K+WNK3 siRNA+Baf-A1组的Maxi K蛋白表达无明显变化(P＞0.05);与Maxi K+WNK3 siRNA组比较,Maxi K+WNK3 siRNA+Baf-A1组的Maxi K蛋白表达升高(P＜0.01).结论 WNK3激酶通过减少MaxiK通道蛋白的泛素化来抑制Maxi K通道的溶酶体降解途径,从而促进Maxi K通道在细胞内和细胞膜上的表达量.其机制可能与MAPK ERK1/2转导通路有关.
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EP1受体通过激活p38 MAPK通路介导阿霉素诱导的足细胞损伤
目的 探讨前列腺素E2受体1亚型(EP1)在阿霉素(ADR)诱导的足细胞损伤中的作用及其可能机制.方法 (1)动物实验:6～8周龄雄性Balb/c小鼠被随机分为4组:对照组;ADR组;EP1激动剂(17-phenyl PGE2)+ADR组;EP1拮抗剂(SC-19220)+ADR组.尾静脉注射ADR(10 mg/kg)构建小鼠肾病综合征模型,分别给予EP1激动剂(1μg/g)和拮抗剂(25μg/g).检测小鼠尿蛋白量、血生化、肾脏病理改变、电镜下足细胞改变以及足细胞相关蛋白的表达变化.(2)细胞实验:体外培养足细胞,分为4组:对照组;ADR组;EP1激动剂+ADR组;EP1拮抗剂+ADR组.CCK-8法检测足细胞增殖情况;ELISA法检测足细胞前列腺素E2(PGE2)含量;间接免疫荧光法检测足细胞相关蛋白nephrin、podocin、CD2AP在足细胞中的定位;实时定量PCR法及Western印迹法检测足细胞相关蛋白mRNA及蛋白的表达;Western印迹法检测p38 MAPK活性变化;流式细胞术检测细胞凋亡.结果 (1)动物实验结果:与对照组相比,ADR组小鼠出现明显蛋白尿、血生化及肾脏病理改变;与ADR组相比,EP1激动剂+ADR组尿蛋白量增多、血生化异常及肾脏病理改变加重,拮抗剂+ADR组上述改变减轻.免疫组化结果显示,ADR组足细胞相关蛋白nephrin、podocin、CD2AP表达与对照组相比显著降低,EP1激动剂可进一步抑制其表达,拮抗剂干预后上述改变得到改善(均P＜0.05).电镜下观察ADR组足细胞足突增宽、融合,激动剂组足细胞损伤进一步加重,拮抗剂干预后足细胞损伤减轻.(2)细胞实验结果:与对照组相比,ADR组足细胞中PGE2含量、环氧合酶2(COX2)mRNA及蛋白表达增加,nephrin、podocin、CD2AP mRNA及蛋白表达下降,p38 MAPK活性增加,足细胞凋亡显著增多(均P＜ 0.05).EP1激动剂干预后上述改变加重(均P＜0.05);拮抗剂可下调PGE2及COX2 mRNA及蛋白的表达,上调nephrin、podocin、CD2AP mRNA及蛋白表达,抑制p38 MAPK活性,抑制足细胞凋亡(均P＜0.05).加入p38 MAPK抑制剂(10 μmol/L)可以减轻EP1激动剂对足细胞相关蛋白nephrin、podocin、CD2AP表达的抑制作用.结论 EP1受体可能通过激活p38 MAPK信号通路抑制足细胞相关蛋白nephrin、podocin、CD2AP的表达,介导ADR诱导的足细胞损伤,抑制EP1受体对足细胞有保护作用.
