人皮肤角质形成细胞的胰蛋白酶消化分离及无血清培养
摘要： 目的探索用DMEM-SF培养基对经胰蛋白酶两步消化分离的人角质形成细胞进行培养的方法和条件. 方法取临床整形外科手术后剩余皮肤,用0.25%的胰蛋白酶经冷和温两步消化分离后,用DMEM-SF完全培养基于5% CO2、37℃培养,绘制生长曲线,并用单克隆抗角蛋白抗体和鼠-IgG免疫组化试剂盒进行细胞鉴定. 结果用胰蛋白酶两步消化分离的角质形成细胞在DMEM-SF培养基中可正常生长2周以上,生长曲线显示细胞在第4天进入对数生长期,第10天进入停滞期.鉴定显示角质形成细胞占95%以上.来源于3个不同个体的皮肤角质形成细胞经等量混合后培养与单独培养相比,细胞生长无统计学差异. 结论用胰蛋白酶对人皮肤进行冷和温两步消化分离的角质形成细胞,在DMEM-SF完全培养基中生长状况良好,其他细胞污染少,实验成本低廉,操作简单.
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激活型人源化抗人CD137单克隆抗体的研制与生物学活性鉴定
目的 制备鼠抗人CD137抗体,并对该抗体进行人源化改造.方法 构建hCD137-pCDNA3.4真核表达质粒,经293F细胞表达纯化及鉴定后,获得CD137蛋白.制备pHAGE-CMV-MCS-IRES-ZsGreen-hCD137的慢病毒,感染HEK-293FT细胞,获得用来筛选杂交瘤的CD137转基因细胞株.将CD137蛋白免疫小鼠,检测小鼠血清抗体效价,将免疫小鼠的脾脏和骨髓瘤细胞SP2/0融合,采用ELISA方法及流式细胞术对小鼠杂交瘤进行筛选.将筛选后的杂交瘤细胞接种小鼠,获得腹水.对抗体亚型和抗体效价进行测定,并通过竞争结合抑制实验等方法对所获的CD137单抗的生物学特性进行分析鉴定.提取该mAb杂交瘤细胞株的总RNA逆转录成cDNA,进行鼠抗人CD137抗体可变区序列克隆,构建人源化抗体重链和轻链表达载体,瞬时转染HEK-293FT,检测分析各重组人源化抗体与抗原的亲和力.结果 获得1株CD137单抗(6F5),该抗体与CD137L有竞争作用.蛋白结合表位在A.A 30-100.6F5能够激活NF-κB信号通路,对外周血单个核细胞增殖具有显著促进作用,且人源化后抗体的亲和力不变.结论 成功制备1株CD137人源化抗体,该人源化抗体为下一步开展体内肿瘤治疗奠定了基础.
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高氧对新生大鼠脑内谷氨酸及其转运体的影响
目的 研究新生大鼠在高氧中脑组织内谷氨酸(Glu)浓度的变化及机制,探讨谷氨酸及其转运体在高氧脑损伤中的作用.方法 高氧组将新生6d大鼠置于体积分数为80％高氧下持续暴露24 h,建立新生大鼠未成熟脑高氧损伤模型,对照组将新生大鼠置于正常空气中7d.两组新生大鼠均于第7天分别断头取脑组织,应用ELISA法检测脑组织内Glu及γ-氨基丁酸(GABA)蛋白含量;应用Westernblot法检测高亲和力谷氨酸转运体EAAT1、EAAT2、EAAT3,脑型葡萄糖转运体GLUT1、GLUT3及囊泡谷氨酸转运体VGLUT1、VGLUT2的蛋白表达情况.结果 与对照组比较,高氧组谷氨酸转运体EAAT2、EAAT3、GLUT1和VGLUT2的蛋白表达降低,差异有统计学意义(P＜0.05),而EAAT1、GLUT3和VGLUT1的蛋白表达与对照组比较差异无统计学意义;高氧组脑组织内Glu/GABA的比值较对照组明显增高,差异有统计学意义(P＜0.05).结论 高氧可导致新生大鼠脑组织内Glu/GABA的比值增高,其机制与EAAT2、EAAT3、GLUT1和VGLUT2的蛋白表达下降有关.Glu增加可能是高氧造成脑损伤的原因之一.
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ApoJ基因修饰的BMSCs移植对脑出血大鼠C3表达的影响
目的 探讨载脂蛋白J(ApoJ)基因修饰的骨髓间充质干细胞(BMSCs)移植对脑出血大鼠补体3(C3)表达的影响.方法 采用贴壁筛选法体外培养并纯化大鼠BMSCs,利用脂质体介导重组质粒pEGFP-N1-ApoJ转染BMSCs.建立大鼠尾状核脑出血模型,随机分为ApoJ/BMSCs组、BMSCs组和NS组,每组24只,三组分别于建模后24h在脑出血部位移植等体积转染ApoJ基因的BMSCs悬液、BMSCs悬液、生理盐水,各组再根据移植后喂养时间不同分为1、3、5、7d4个亚组,每亚组6只.采用RT-PCR法和免疫组织化学染色技术分别检测血肿周围脑组织C3 mRNA和蛋白质的表达情况.结果 应用全骨髓贴壁法成功分离、培养出活性及纯度较高的BMSCs,携带ApoJ基因的BMSCs能够表达外源性ApoJ.RT-PCR和免疫组化结果显示,与NS组和BMSCs组比较,ApoJ/BMSCs组各时间点C3的mRNA和蛋白表达均明显降低(P＜0.05),且BMSCs组亦低于NS组(P＜o.05).结论 ApoJ基因修饰的BMSCs能明显下调C3的表达,证实ApoJ对脑出血的神经保护作用是通过抑制补体激活而实现的.
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内源性γ-干扰素对斑马鱼血管发育的影响
目的 探索内源性γ-干扰素(IFN-γ)对斑马鱼血管发育的影响.方法 利用反义吗啉环寡聚核苷酸(MO)技术下调斑马鱼IFN-γ受体crfb17的表达,并通过激光共聚焦成像分别观察胚胎受精后3d和5d的脑血管发育情况与胚胎受精后28 h和31 h的躯干血管发育情况;进一步利用软件分析胚胎受精后3d时crfb17 MO组和对照MO组中脑网络特征的差异.结果 下调斑马鱼IFN-γ受体crfb17后,斑马鱼脑血管和躯干血管的发育受到明显抑制,胚胎受精后3d时crfb17 MO组的中脑血管总长度、血管节段数、血管密度都较对照MO组显著降低(P ＜0.001).结论 内源性IFN-γ在斑马鱼血管发育阶段具有促血管生成的作用.
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长链非编码CCAT1靶向miR-219a对宫颈癌Hela细胞生长、侵袭和迁移的调节作用
目的 探究长链非编码RNA结肠癌相关转录因子1(CCAT1)对宫颈癌细胞增殖、侵袭和迁移的调节作用及作用机制.方法 RT-PCR法检测CCAT1 shRNA(sh-CCAT1)转染细胞后CCAT1的表达水平和sh-CCAT1+miR-219a inhibitor或CCAT1+miR-219a mimic转染细胞后miR-219a的表达情况.荧光素酶报告实验验证CCAT1和miR-219a的靶向关系.流式细胞术和CCK-8法检测细胞生存能力,Transwell实验检测细胞侵袭能力,Western blot法检测细胞增殖、凋亡和迁移相关蛋白的表达.结果 sh-CCAT1能显著抑制CCAT1的表达并能显著减弱miR-219a inhibitor对miR-219a表达的抑制作用;CCAT1能明显减弱miR-219a mimic诱导miR-219a表达的作用;同时,荧光素酶报告实验表明CCAT1和miR-219a存在靶向关系;sh-CCAT1能显著抑制Hela细胞增殖及侵袭、诱导细胞凋亡;miR-219a inhibitor能显著减弱sh-CCAT1对Hela细胞增殖、侵袭的抑制作用及对细胞凋亡的促进作用;此外,sh-CCAT1还能明显抑制Ki67和基质金属蛋白酶-9(MMP-9)表达、促进半胱天冬酶(Caspase-3)表达,miR-219a inhibitor能明显减弱sh-CCAT1对Ki67、MMP-9和Caspase-3表达的调控作用.结论 CCAT1能通过下调miR-219a表达促进宫颈癌细胞增殖和迁移、抑制细胞凋亡.
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BDNF在慢性不可预见性温和刺激应激大鼠海马星形胶质细胞中的表达
目的 观察脑源性神经营养因子(BDNF)在慢性不可预见性温和刺激(CUMS)大鼠海马星形胶质细胞中的表达变化情况.方法 将60只成年大鼠随机分为应激组(n=30)和对照组(n=30),应激组大鼠给予CUMS,对照组每天随机抓取一次.分别采用糖水偏好实验、旷场实验和Morris水迷宫实验对两组大鼠进行行为学检测;免疫荧光双标法检测大鼠海马星形胶质细胞特异性标志蛋白胶质纤维酸性蛋白(GFAP)和BDNF蛋白的共定位;采用Western blot法检测大鼠海马组织中BDNF蛋白表达水平.结果 ①糖水偏好实验:应激组大鼠的糖水消耗量及糖水偏好率均低于对照组(P＜0.01);②旷场实验:与对照组相比,应激组大鼠的行走总路程、中央活动时间、站立次数、修饰行为次数均偏低(P＜0.01);③Morris水迷宫实验:与对照组比较,应激组大鼠平均逃避潜伏期明显延长(P＜0.01);④GFAP和BDNF免疫荧光双标结果:部分星形胶质细胞的胞质内GFAP和BD-NF有共定位;⑤Western blot法检测结果:CUMS后1、7、14d应激组大鼠海马组织中BDNF的表达水平均低于对照组(P＜0.01).结论 CUMS大鼠海马星形胶质细胞中BDNF表达水平降低,这可能与抑郁症的发病机制有关.
关键词： 慢性不可预见性温和刺激 海马 星形胶质细胞 脑源性神经营养因子 大鼠 -
PKH26荧光素标记脂肪间充质干细胞的生物学特性的研究
目的 研究PKH26荧光素染料对脂肪间充质干细胞(ADSCs)生物学特性的影响.方法 分离培养新生SD大鼠的ADSCs,通过流式细胞仪、成脂、成骨、成软骨诱导鉴定ADSCs的免疫表型和多向分化的能力.用细胞膜荧光素染料PKH26对第二代脂肪干细胞进行标记,通过倒置相差显微镜、荧光显微镜以及CCK-8法评估标记后细胞的形态、荧光强度以及增殖活性的变化.结果 成功分离和培养AD-SCs,其纯度达95％以上,并成功将ADSCs诱导成脂肪、骨、软骨;PKH26标记24 h后,在荧光显微镜下可见细胞膜上均匀分布的强红色荧光,细胞的形态以及增殖活性与未标记的细胞无明显差异.结论 PKH26荧光素染料标记后对AD-SCs的形态及增殖活性无明显影响,是一种理想的细胞标志物,能够很好的应用于示踪间充质干细胞的迁移转归及干细胞标记等方面的研究.
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c-Myc调控长链非编码RNA7对舌鳞癌细胞增殖的影响
目的 探究由c-Myc调控的长链非编码RNA7(lncRNA7)对舌鳞癌细胞增殖的作用.方法 Western blot检测pLKO.1-shc-Myc和Flag-c-Myc分别转染至舌鳞癌SCC3细胞中原癌基因c-Myc的表达情况,qRT-PCR检测下调或上调c-Myc对lncRNA7表达水平的影响.将构建的pLKO.1-shlncRNA7表达载体转染入SCC3,获取低表达lncRNA7的细胞.MTT法和细胞克隆实验分别检测敲低lncRNA7后对SCC3细胞生长和增殖的影响.荧光原位杂交实验检测lncRNA7在细胞中的定位.结果 成功下调或上调SCC3细胞中c-Myc表达,lncRNA7水平也随之降低或升高.成功敲低SCC3细胞中lncRNA7表达,SCC3细胞生长减慢,克隆数量减少.荧光原位杂交实验结果证明lncRNA7定位于舌鳞癌细胞SCC3的胞质中.结论 敲低受c-Myc正调控的lncRNA7表达能抑制舌鳞癌细胞增殖,表明lncRNA7可能成为舌鳞癌潜在的治疗靶点.
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吗啡与布托啡诺对肺腺癌细胞A549侵袭与迁移的影响
目的 分析吗啡与布托啡诺对肺腺癌细胞A549侵袭与迁移的影响及可能的作用机制.方法 人肺腺癌A549细胞随机分为吗啡组与布托啡诺组.每组均分别设置吗啡、布托啡诺与拮抗剂不同浓度.采用免疫组化法、Transwell法、细胞划痕法评估吗啡与布托啡诺及其对应的拮抗剂对肺腺癌细胞A549侵袭与迁移及相关蛋白表达的影响及作用机制.结果 随着布托啡诺剂量的增加,A549细胞侵袭数明显减少,而随着吗啡剂量的增加,A549细胞侵袭数明显增加(P＜0.05);随着布托啡诺剂量的增加及时间延长,A549细胞迁移变化不明显,而随着吗啡剂量的增加A549细胞迁移数明显增加(P＜0.05);Nor-Binaltorphimine(Nor-BNI)剂量为0.1 μmol/L时,A549细胞侵袭数明显增加.与单纯布托啡诺组比较,加入Nor-BNI后,每组对应剂量的A549细胞侵袭数明显增加.与单纯吗啡组比较,随着甲基纳曲酮剂量的增加,A549细胞侵袭数明显减少.10 μmol/L布托啡诺作用肺腺癌A549细胞24h后,相关蛋白表达下调,而吗啡作用后表达上调(P＜0.05).结论 吗啡可促进肺腺癌细胞A549的迁移与侵袭,并上调MMP-2、MMP-9、Fascin蛋白表达,而布托啡诺则抑制肺腺癌细胞A549的迁移与侵袭,并下调MMP-2、MMP-9、Fascin蛋白表达.
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8q24基因多态性和安徽人群前列腺癌的相关研究
目的 探讨8q24基因中2个单核苷酸多态性(SNP)rs10090154、rs16901966和安徽人群前列腺癌的相关性.方法 采用病例对照研究方法从安徽人群中筛选出90例前列腺癌患者作为病例组,139例健康体检者作为对照组,运用MassARRAY DNA基因分型方法对8q24区rs10090154和rs16901966位点进行基因测序,分析其中基因型和等位基因频率的分布,并研究其与年龄、体重指数(BMI)、收缩压(SBP)、肿瘤分期、Gleason评分、血清前列腺特异性抗原(PSA)水平等临床特征之间的关系.结果 在病例与对照组之间,8q24区rs10090154和rs16901966位点的基因型和等位基因型频率差异均具有统计学意义(P＜0.05);分层分析显示,rs10090154在年龄≤70岁(P =0.002,OR =3.814,95％CI:1.634～8.901)、BMI＞ 23 kg/m2 (P=0.001,OR=3.449,95％ CI:1.629 ～7.303)、SBP≥ 140 mmHg (P=0.008,OR=3.148,95％ CI:1.352 ～7.328)的人群中相对于野生基因型CC,突变基因型CT/TT可能有较高的前列腺癌发病风险,rs16901966位点在年龄＞70岁(P =0.024,0R =2.567,95％ CI:1.132 ～5.818)、BMI＞ 23 kg/m2(P=0.029,OR=2.030,95％CI:1.074 ～3.838)的人群中,突变基因型AG/GG前列腺癌的发病率比野生型AA更高;另外,在不同肿瘤分期、Gleason评分和PSA水平的患者亚组分析中没有观察到显著的差异.结论 8q24区单核苷酸多态性rs1009015和rs16901966可能是安徽人群前列腺癌发病的危险因素.
关键词： 前列腺癌 rs10090154 rs16901966 相关
