环介导等温扩增法对乙肝病毒的快速检测和分型
摘要： 目的 针对乙肝病毒(HBV)不同亚型,建立环介导等温扩增(loop-mediated isothermal amplification,LAMP).方法,实现对HBV的快速检测及基因分型.方法 分别设计HBV B、C、D三亚型基因组特征序列的LAMP引物,优化反应条件,建立特异灵敏的HBV亚型LAMP检测.方法,并与Real-time PCR.方法 进行临床样本检测结果 比对.结果 LAMP法在数十分钟内有效地检测出HBV的B、C、D三亚型;其中,HBV-B亚型的检出限为17拷贝;C亚型的检出限为25拷贝;D亚型的检出限为10拷贝.与Real-time PCR法相比,灵敏度提高1 000倍左右.结论 LAMP法可实现HBV的快速检测及分型,具有高特异度和高灵敏度,可用于临床检测诊断.
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MELK在舌鳞癌中的表达及对舌鳞癌细胞系CAL-27的迁移与侵袭能力的影响
目的 母体胚胎亮氨酸拉链激酶(MELK)在多种肿瘤中高表达且与肿瘤的发生与发展密切相关,该研究旨在探讨MELK基因在舌鳞癌中的表达及其对肿瘤生物学行为的影响.方法 获取人的舌鳞癌和癌旁组织标本,实时荧光定量PCR和Western blot检测舌鳞癌及癌旁组织中MELK表达.通过siRNA(si001组,si002组)转染技术构建低表达MELK的舌癌细胞系(CAL-27)模型.CCK-8实验检测转染后细胞增殖能力的改变;Transwell小室法检测细胞侵袭能力改变;Transwell小室法检测细胞迁移能力改变.结果 qRT-PCR和Western blot检测发现舌鳞癌组织中MELK基因的表达明显高于癌旁组织(均P＜0.05);成功建立了MELK沉默舌鳞癌细胞系模型,沉默组较控制组和正常组MELK表达明显降低(均P＜0.05);CCK-8实验测得沉默组细胞活力明显低于正常组和控制组(均P＜0.05);Transwell实验检测沉默后CAL-27细胞迁移能力,si001组和si002组与正常组和控制组比较,CAL-27细胞迁移能力降低,差异有统计学意义(均P＜0.01);Transwell小室法检测细胞侵袭能力,si001组、si002组与正常组和控制组比较,CAL-27细胞侵袭能力降低,差异有统计学意义(均P＜0.01).结论 MELK基因在舌鳞癌组织中高表达;siRNA-MELK转染能够有效地构建舌鳞癌细胞系MELK低表达模型;下调MELK的表达水平可抑制CAL-27细胞的生长增殖,降低迁移与侵袭能力.
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咽喉反流通过NF-κB信号通路介导炎症反应对声带黏膜的影响
目的 探究咽喉反流通过NF-κB信号通路介导炎症反应对声带白斑患者声带黏膜的影响.方法 选取2015年6月至2017年6月在深圳市人民医院耳鼻咽喉头颈外科行声带白斑切除手术的患者,根据反流性喉炎症状指数量表(RSI)及反流性喉炎体征指数量表(RFS)及24 h双通道测酸结果将患者随机分为反流组(n=25)、反流+质子泵抑制剂(PPI)组(n=26),选取同期无咽喉反流患者为阴性对照(非反流组,n=30).反流+PPI组口服艾司奥美拉唑镁肠溶片,反流组与非反流组口服安慰剂,记录患者术前及术后8周RSI、RFS测定结果,并取患者术后8周声带黏膜标本,做HE染色检测声带黏膜病理组织学变化;用ELISA法检测声带黏膜中TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-10、IL-13含量;用Western blot法检测声带黏膜中Claudin-3、Occludin、ZO-1及p p65、p-IKK、p-IκB、IκB-α蛋白含量;术后12个月随访患者声带白斑复发情况.结果 反流+PPI组患者声带白斑复发率(26.9％)显著低于反流组(76.0％)(P＜0.05);术后给予PPI治疗8周后,反流+ PPI组RSI、RFS、组织病理学评分显著低于反流组(均P＜0.05),声带黏膜组织上皮结构完整性、纤维异型增生、炎性细胞浸润较反流组明显改善;反流+ PPI组患者声带黏膜促炎因子TNF-α、IL-1β、IL-6含量显著低于反流组(均P＜0.05),IL-10、IL-13含量显著高于反流组(均P＜0.05);且Claudin-3、Occludin、ZO-1、IκB-α蛋白表达显著升高(均P＜0.01),p-p65、p IKK、p-IκB蛋白表达显著低于反流组(均P＜0.01).结论 伴有咽喉反流的声带白斑病患者,给予PPI抑酸治疗后,可明显减轻咽喉反流症状,降低声带白斑复发率,可能是通过下调NF-κB信号通路相关因子,减少促炎因子的分泌,并增强声带黏膜屏障功能.
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屋尘螨诱导人支气管上皮细胞表达炎症介质的机制
目的 通过测定NF-κB/p65 siRNA对屋尘螨刺激的人支气管上皮细胞NF-κB及IL-6、IL-29表达水平的影响,探讨屋尘螨诱导人支气管上皮细胞表达炎症介质的机制.方法 将人支气管上皮细胞分为A组(空白对照组)、B组(300 ng/mL屋尘螨)、C组(300 ng/mL屋尘螨+NF-κB-siRNA)、D组(300 ng/mL屋尘螨+siRNA阴性对照)、E组(NF-κB-siRNA).检测各组细胞NF-κB/p65核蛋白、IL-6、IL-29、NF-κB/p65 mRNA的相对表达量及细胞上清液中IL-29及IL-6的蛋白含量.结果 C组经NF-κB/p65 siRNA转染后,NF-κB/p65核蛋白、NF-κB/p65 mRNA、II-6 mRNA、IL-29 mRNA及细胞上清液中IL-6及IL-29的蛋白含量仍然高于A组,但低于B组及D组,组间差异有统计学意义(F值分别为169.564、204.442、144.995、54.499、147.983、116.825,均P＜0.01).结论 NF-κB/p65 siRNA有效地抑制人支气管上皮细胞NF-κB/p65的表达后,炎症因子IL-6、IL 29表达亦减少.屋尘螨可能通过激活NF-κB信号通路,引起炎症因子IL-29、IL-6的表达增加,参与屋尘螨引起的气道炎症的发生发展过程.
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亮氨酸干预对胰岛素抵抗大鼠胆汁酸代谢的影响
目的 观察亮氨酸对大鼠胰岛素抵抗、血清胆汁酸水平、胆汁酸代谢相关基因等指标的影响,进一步揭示亮氨酸调节胰岛素抵抗大鼠糖脂代谢的机制.方法 雄性6周龄SD大鼠24只随机分为3组,分别喂饲普通饲料、高脂饲料,高脂饲料添加1.5％亮氨酸.喂养32周,进行葡萄糖耐量实验(GTT)和胰岛素耐量实验(ITT),计算葡萄糖曲线下面积(AUC).实验结束后,收集大鼠血清和肝脏组织,测定血清胰岛素、葡萄糖水平,计算胰岛素抵抗指数(HOMA-IR),评价胰岛素敏感性.检测血清及肝脏中总胆固醇(TC)和三酰甘油(TG)水平,实时荧光定量逆转录-聚合酶链反应(Real-time PCR)测定大鼠肝脏中胆汁酸合成相关基因肝X受体(LXRα)、法尼酯X受体(FXR)、胆固醇7α羟化酶(CYP7A1)、胆固醇27α羟化酶(CYP27A1) mRNA的表达,超高效液相色谱串联质谱法(UPLC-MS/MS)测定大鼠血清中17种胆汁酸的水平.结果 亮氨酸干预能够显著降低高脂喂养大鼠血清TC、TG和肝脏TG水平,改善脂代谢.亮氨酸对血糖和血胰岛素水平没有显著影响,但是能够有效降低HOMA-IR和葡萄糖耐量实验AUC水平,改善胰岛素抵抗.亮氨酸能够显著升高高脂喂养大鼠血清胆汁酸水平和LXRα、FXR、CYP27A1 mRNA水平,但对CYP7A1 mRNA的表达没有影响.结论 亮氨酸干预能够显著增加胰岛素抵抗大鼠的胆汁酸合成,减少血清中脂肪的堆积,改善糖脂代谢,增强其胰岛素敏感性,胆汁酸合成相关基因表达的改变可能是其重要机制.
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载脂蛋白A1通过Wnt/β-catenin信号通路调控EMT在甲状腺癌转移中的作用
目的 探讨载脂蛋白A1 (ApoA1)对甲状腺癌细胞侵袭和迁移的影响及可能的作用机制.方法 免疫组织化学染色法检测73例甲状腺癌和50例甲状腺结节组织(对照组)ApoA1表达,实时荧光定量PCR和Western blot法检测人甲状腺乳头状癌TPC-1细胞和正常人甲状腺Nthy-ori 3-1细胞ApoA1表达;通过转染pLKO.1-shApoA1敲低TPC-1细胞ApoA1表达,Transwell小室检测细胞侵袭和迁移能力,Western blot法检测上皮细胞-间充质转化(EMT)和Wnt/β-catenin信号通路相关蛋白表达.结果 甲状腺癌转移组、无转移组ApoA1染色评分明显高于对照组,转移组ApoA1染色评分又明显高于无转移组(均P＜0.05).TPC-1细胞ApoA1 mRNA和蛋白表达明显高于Nthy-ori 3-1细胞,差异具有统计学意义(P＜0.01).ApoA1表达与甲状腺癌转移和临床分期有关(均P＜0.05),与性别、年龄、病理分型等无关(均P＞0.05).敲低ApoA1表达可显著降低TPC-1细胞侵袭、迁移能力和抑制EMT转换能力,ApoA1-siRNA组侵袭和迁移细胞数明显少于空白对照组和空载质粒(EV)组,E-cadherin蛋白表达明显高于空白对照组和EV组,Vimentin蛋白表达明显低于空白对照组和EV组,差异均具有统计学意义(均P＜0.01).敲低ApoA1表达可明显抑制Wnt/β-catenin通路相关蛋白表达,ApoA1-siRNA组CK2α、-catenin、Survivin蛋白表达明显低于空白对照组和EV组,差异具有统计学意义(均P＜0.01).结论 抑制ApoA1表达使甲状腺癌细胞侵袭和迁移能力减弱,其作用机制可能与阻断Wnt/β-catenin信号通路、抑制细胞发生EMT有关.
关键词： 载脂蛋白A1 甲状腺癌 上皮细胞-间充质转化 信号通路 -
Nrf2信号通路在镉致大鼠生殖毒性中的作用
目的 探讨Nrf2信号通路在镉致大鼠生殖毒性中的作用.方法 SD大鼠随机分为4组,每组6只.第1组为对照组,第2～4组为氯化镉低、中、高剂量组.第1组给予腹腔注射0.9％生理盐水,第2～4组分别给予腹腔注射1.14、2.28、4.56 mg/kg体重的CdCl2溶液,48 h后处死动物,解剖取出大鼠睾丸、卵巢组织测定超氧化物歧化酶(SOD)活力、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)活力、脂质过氧化物丙二醛(MDA)含量,并用Real-time PCR和Western blot法分别测定核转录因子NF-E2相关因子2(Nrf2)、谷胱甘肽-S-转移酶P1亚基(GST-P1)、谷氨酸半胱氨酸连接酶催化亚基(GCLC)的mRNA和Nrf2蛋白的表达水平.结果 在1.14、2.28、4.56 mg/kg剂量条件下,大鼠睾丸和卵巢SOD、GSH Px活性均明显低于对照组(均P＜0.05),MDA含量有所升高(P＜0.05).2.28和4.56 mg/kg组大鼠睾丸和卵巢Nrf2 mRNA和蛋白的表达水平均显著高于对照组(均P＜0.05),大鼠睾丸Nrf2 mRNA和蛋白的表达与氯化镉染毒剂量均存在明显的剂量-效应关系(均P＜0.05).2.28和4.56 mg/kg组大鼠睾丸GST-P1和GCLC mRNA表达均显著高于对照组(均P＜0.05),大鼠卵巢GST-P1、GCLC mRNA在4.56 mg/kg剂量条件下的表达显著升高(均P＜0.05),但GST-P1和GCLC mRNA表达分别在1.14和2.28 mg/kg剂量条件下出现显著的下降(均P＜0.05).结论 在一定染毒剂量条件下,镉可引起大鼠睾丸和卵巢发生氧化应激,激活Nrf2介导的抗氧化机制,上调下游Ⅱ相解毒酶的转录表达.雌性大鼠卵巢可能比雄性大鼠睾丸更容易受到镉毒性作用的损害.
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小檗碱调控线粒体功能改善2型糖尿病引起的肝脏脂质代谢紊乱
目的 探讨小檗碱对糖尿病肝脏病变的作用,及线粒体参与其中的相关分子机制.方法 实验分为3组:正常组(WT),糖尿病组(db/db)和小檗碱治疗组(db/db+ BBR).HE染色观察肝脏组织形态改变;检测血浆总胆固醇(TC)、总三酰甘油(TG)、谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)及低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)的水平;Western blot法检测肝组织线粒体相关蛋白的改变.结果 与正常组相比,db/db组中TG、TC、LDL-C的含量明显增加,而HDL-C含量明显降低,ALT、AST蛋白水平也显著提高;与db/db组相比,小檗碱治疗组各指标明显改善,差异具有统计学意义(均P＜0.05).同时,小檗碱显著改善糖尿病性肝脏引起的空泡化.此外,小檗碱激活线粒体自噬发生和线粒体生成途径,改善糖尿病性肝脏病变.结论 小檗碱具有改善糖尿病性肝脏病变的作用.
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miR-19a调控血小板反应蛋白在结肠癌淋巴转移中的机制
目的 探讨miR-19a调控血小板反应蛋白(THBS1)在结肠癌淋巴转移中的机制.方法 采用实时定量聚合酶链反应(qRT-PCR)的方法检测不同结肠癌细胞株(LOVO、HT116、SW480、HT29)中的miR-19a的表达水平;蛋白免疫印迹法(Western blot)/免疫共沉淀(CO-IP)技术检测LOVO与HT29细胞中THBS1及血管内皮生长因子C/D(VEGF-C/D)蛋白结合及表达情况;Western blot法检测转染后细胞中THBS1、VEGF-C/D的表达情况;细胞划痕法检测转染后细胞的迁移能力.取shRNA、shRNA-NC转染后的LOVO细胞以及正常LOVO细胞分别接种于裸鼠皮下,建立裸鼠移植瘤模型观察成瘤情况,免疫组化法检测肿瘤组织中CD34的表达,Western blot法检测瘤体中THBS1、VEGF-C、VEGF-D蛋白的表达.结果 细胞株LOVO和HT29的miR-19a的表达量分别为高和低;THBS1蛋白在HT29细胞中高表达,VEGF-C/D蛋白在LOVO细胞中高表达;LOVO和HT29细胞中THBS1和VEGF-C免疫共沉淀反应为阳性;转染miR-19a后,LOVO细胞的迁移能力显著下降,而HT29细胞迁移能力有显著上升.注射了miRNA抑制物组的裸鼠瘤块明显变小;瘤块组织中THBS1的蛋白表达显著上升,VEGF-C的蛋白表达显著下降,CD34的阳性表达降低.结论 miR-19a能够通过下调THBS1促进VEGF-C的表达,从而促进结肠癌淋巴结转移.
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猪尾小组织块贴壁培养法分离培养成纤维细胞及转染效率的研究
目的 采取猪尾小组织块贴壁法成功分离培养出原代猪成纤维细胞并进行细胞不同时期的绿色荧光蛋白(green fluorescent protein,GFP)阳性质粒转染效率的研究.方法 猪尾小组织块贴壁培养法分离培养出原代猪成纤维细胞后,传代并进行冻存和复苏,比较猪成纤维细胞原代培养、传代培养和复苏细胞存活率.绘制细胞原代培养、传代培养和复苏后的生长情况.分别在猪尾小组织块贴壁培养获得原代成纤维细胞,细胞传代和复苏后进行细胞GFP阳性质粒的Neon电转染,比较不同转染时期细胞存活率和生长情况,转染后24 h和48 h分别采用荧光显微镜和流式细胞仪检测细胞的GFP质粒阳性表达率.结果 猪尾小组织块贴壁培养可以成功分离培养出猪成纤维细胞,细胞冻存后复苏能保持原代细胞生物学特性,原代细胞活力很高,细胞存活率97.670％,传代培养后细胞存活率95.670％,复苏细胞存活率仍在90％以上.原代培养、传代培养和复苏培养细胞生长曲线均呈“S”型,复苏细胞生长略微缓慢.原代培养、传代培养和复苏细胞电转染后细胞存活率均有少许下降,细胞生长增殖能力减弱,但是细胞生长曲线仍呈“S”型曲线.Neon电转染后24 h均可获得GFP质粒阳性表达的猪成纤维细胞,荧光显微镜均检测到GFP质粒阳性表达的成纤维细胞,48h后流式细胞仪检测显示原代细胞阳性率8.01％,稍高于传代细胞的7.91％和复苏细胞的7.86％.复苏细胞存活率下降,转染后细胞活力下降,但转染后仍可得到7.86％GFP质粒阳性表达的猪成纤维细胞,原代培养细胞能够获得更高的阳性率,差异有统计学意义.结论 猪尾小组织块贴壁培养法可以成功分离培养出成纤维细胞,细胞传代会对细胞活力有影响,冻存后复苏也会影响细胞的存活率和细胞增殖能力.原代细胞、传代细胞和复苏细胞转染均能获得GFP阳性质粒表达.原代培养细胞具有更佳的细胞活力和阳性转染率,进行基因敲除或基因敲入等基因编辑和体细胞克隆研究,选择原代细胞作为转染对象能获得更好的基因编辑成功率.
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蛋白激酶C和半乳糖凝集素-3对心肌纤维化、心力衰竭的影响及作用机制
目的 探讨蛋白激酶C(PKC)和半乳糖凝集素-3(Galectin-3)对心肌纤维化的影响及调控机制.方法 分别用PKC-α激动剂二丁酸佛波醇酯(PDB)、PKC-α抑制剂白屈菜红碱(Chel)、Galectin-3抑制剂β乳糖和血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)处理心肌HL-1细胞,Western blot检测细胞PKC-α、Galectin-3、Ⅰ型胶原α1(ColⅠα1)蛋白表达;再向HL-1细胞转染pcDNA4/PKC-α或pcDNA4/Galectin-3,验证高表达PKC-α和Galectin-3对HL-1细胞ColⅠα1表达的影响.结果 PDB处理后HL-1细胞Galectin-3、ColⅠα1蛋白表达明显高于对照组,Chel处理后HL-1细胞Galectin-3、ColⅠα1蛋白表达明显低于对照组,差异具有统计学意义(均P＜0.05).Chel预处理HL-1细胞可以显著降低由PDB诱导的Galectin-3表达(P＜0.05);转染pcDNA4/PKC-α后HL-1细胞Galectin-3和ColⅠα1蛋白表达显著升高(均P＜0.01).高表达Galectin-3诱导细胞ColⅠα1蛋白表达明显升高,β-乳糖预处理HL-1细胞可以显著降低由PDB诱导的ColⅠα1表达(P＜0.01).AngⅡ处理可以明显上调HL-1细胞PKC-α、Galectin-3、ColⅠα1蛋白表达(均P＜0.05),Chel预处理HL-1细胞可以显著降低由AngⅡ诱导的Galectin-3、ColⅠα1蛋白表达(均P＜0.05).结论 PKC-α可能通过调节Galectin-3表达参与心肌纤维化和心力衰竭的发生.
