赤水金钗石斛rDNA ITS序列分析
摘要： 目的:对赤水金钗石斛ITS序列进行序列测定与分析,探讨赤水金钗石斛在ITS片段上的遗传特征,提高道地药材赤水金钗石斛在分子水平的鉴定标准.方法:用特异引物进行PCR扩增,扩增产物纯化后用双脱氧终止法(Sangerdideoxy)测序. 结果:通过与基因库登录的金钗石斛ITS对照,赤水金钗石斛ITS1与ITS2序列的起止范围分别为1～231 bp和395～636 bp.赤水金钗石斛在8位缺失碱基C,在12位缺失碱基A,在82位为碱基A;据此,以NJ法(邻接法)构建了系统树.测序结果登录基因库,序列号:EF618732.结论:金钗石斛ITS1序列基因多态性比ITS2序列更显著;该实验结果为道地药材赤水金钗石斛的物种鉴定补充了新的遗传数据.
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不同严重程度脓毒症小鼠骨髓中性粒细胞 PD-L1的表达及其机制
目的:观察不同严重程度脓毒症小鼠骨髓中性粒细胞程序性死亡配体1(PD-L1)表达的变化并探讨其初步机制.方法:1.在体实验部分:取30只雄性C57/B6小鼠按随机原则分为假手术组(n=10)、轻症盲肠结扎穿孔组(轻症CLP组,n=10)及重症盲肠结扎穿孔组(重症CLP组,n=10),术后24 h留取肝脏、肺脏组织,进行组织病理学检查;同时检测模型小鼠骨髓中性粒细胞比例及PD-L1表型;另取30只小鼠重复上述分组及实验步骤,术后连续观察72 h,进行生存率分析.2.体外实验部分:取小鼠骨髓中性粒细胞,分为正常对照组、脂多糖(1μg/mL)刺激组进行中性粒细胞趋化功能及吞噬功能检测,另外将中性粒细胞分为对照组、脂多糖组、P38 MAPK抑制剂SB 203580(10μmol/L)组、SB 203580(10μmol/L)+脂多糖组,流式细胞术检测各组中性粒细胞PD-L1表型.结果:1.在体实验:轻症CLP组和重症CLP组生存率均显著低于假手术组(P<0.05和0.01),肝脏、肺脏炎症病理评分均显著高于假手术组(均P<0.01),骨髓中性粒细胞比例均显著低于假手术组(均P<0.01);轻症CLP组中性粒细胞表达PD-L1的比例为(2.130±0.37)％,重症CLP组为(4.587±0.5012)％,均显著高于假手术组[(0.7333±0.1097)％,均P<0.01].体外实验:脂多糖组骨髓中性粒细胞的趋化距离显著低于对照组(P<0.01),而吞噬细菌的细胞阳性率[(16.310±2.6530)％]显著高于对照组[(8.463±0.8715)％,P<0.01];脂多糖组骨髓中性粒细胞PD-L1阳性表达率为(72.27±1.656)％,显著高于对照组[(1.713±0.5196)％,P<0.01],使用SB 203580后,经过脂多糖刺激,中性粒细胞PD-L1阳性率为(37.17±1.38)％,显著低于脂多糖组(P<0.01).结论:中性粒细胞向组织器官浸润及其PD-L1表达随脓毒症加重而增加,感染状态下中性粒细胞表面PD-L1的表达受P38 MAPK通路调节.
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玛咖多糖增强机体免疫状态提高5-氟尿嘧啶对荷瘤小鼠的疗效
目的:观察玛咖多糖预处理荷瘤小鼠对5-氟尿嘧啶(5-FU)治疗效果的影响;考察在实施化疗前和化疗过程中应用玛咖多糖以调整机体免疫状态和辅助化疗的可能性.方法:将30小鼠随机分为5组,每组6只;空白对照组、5FU组采用PBS灌胃,其余分别采用低、中、高剂量玛咖多糖灌胃;建立肺癌移植瘤(LLC)小鼠模型;除空白组外,其余4组小鼠均腹腔注射5-FU.观察抑瘤效果并分别计算抑瘤率,通过流式细胞术分析脾脏CD4+T细胞、CD8+T细胞和Treg细胞的数量与比例.结果:体内实验显示,5-FU组、低、中、高剂量玛咖多糖辅助5-FU组的平均肿瘤抑制率分别为51.16％、51.38％、62.17％和69.78％.流式细胞术分析结果显示,1000 mg/kg玛咖多糖+5-FU组的CD4+T细胞比例较单独5-FU处理组显著升高(P<0.05).结论:玛咖多糖辅助5-FU治疗,可明显减缓肿瘤生长速度,提高抑瘤率.
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大鼠脊髓缺血再灌注损伤后钙敏感受体的表达 变化及其抑制剂NPS2390的作用
目的:探讨大鼠脊髓缺血再灌注损伤后钙敏感受体(calcium-sensing receptor,CaSR)的表达变化以及CaSR抑制剂NPS2390对大鼠脊髓缺血再灌注损伤的影响.方法:将48只SD大鼠随机分成假手术组(n=16),模型组(n=16)和NPS2390组(n=16).假手术组仅开腹,不夹闭腹主动脉;模型组阻断腹主动脉30 min后再灌注;NPS2390组在建模前2 d尾静脉注射CaSR抑制剂NPS2390.每组按术后6、12、24 h和48 h细分为4个亚组.各组分别行BBB评分评判大鼠后肢运动功能,蛋白质印迹及免疫组织化学测定CaSR表达变化,TUNEL染色检测大鼠脊髓组织细胞凋亡情况.结果:模型组及NPS2390组BBB评分均明显低于假手术组(P<0.05),NPS2390组各时间点评分高于模型组(P<0.05).蛋白质印迹结果显示,假手术组各时间点CaSR蛋白表达无明显差异(P>0.05);与假手术组相比,模型组6～24 h CaSR表达量随时间延长增加,24 h表达高,但NPS2390组低于模型组(P<0.05);免疫组化结果与其一致.假手术组未见明显凋亡细胞;模型组各时间点细胞凋亡数均高于NPS2390组(P<0.05),两组24、48 h细胞凋亡数均高于同组6 h和12 h(P<0.05),24 h与48 h间细胞凋亡数差异无统计学意义(P>0.05).结论:大鼠脊髓缺血再灌注损伤后CaSR表达逐渐升高,24 h为高峰;CaSR抑制剂NPS2390对大鼠脊髓缺血再灌注损伤具有保护作用.
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超低剂量纳洛酮对地佐辛治疗切口痛模型大鼠 术后疼痛效能的影响
目的:观察超低剂量纳洛酮(<1μg/kg)对地佐辛镇痛作用的影响.方法:选择24只雄性SD大鼠,按照随机数字表法均分为生理盐水组、纳洛酮组、地佐辛组、地佐辛+纳洛酮组,每组6只,参照Brennan法建立大鼠切口痛模型,模拟临床患者手术后疼痛.分别于术后经尾静脉给予等体积生理盐水、纳洛酮(1 ng/kg)、地佐辛(1 mg/kg)、地佐辛(1 mg/kg)+纳洛酮(1 ng/kg).分别于术前1 d和术后2 h、1 d、3 d、5 d、7 d测量大鼠手术足机械缩足反应阈值(PWT),评价不同药物的镇痛效果.结果:术后2 h,与生理盐水组比较,纳洛酮组PWT值无显著差异(P>0.05),地佐辛组与地佐辛+纳洛酮组PWT值显著增高(P<0.01);地佐辛+纳洛酮组PWT值明显高于地佐辛组(P<0.01).术后1、3、5、7 d 4组间PWT值差异无统计学意义(P>0.05);与术前相比,4组术后1 d、3 d PWT值明显降低(P<0.01);术后5 d、7 d差异无统计学意义(P>0.05).结论:超低剂量纳洛酮无镇痛作用,但与地佐辛联用,可以增强后者的镇痛作用.
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白藜芦醇通过诱导G-MDSCs凋亡和M-MDSCs分化 延缓Lewis荷瘤小鼠肿瘤生长
目的:探讨白藜芦醇对髓源抑制性细胞(myeloid-derived suppressor cells,MDSCs)的影响及其抗肿瘤免疫的作用.方法:建立小鼠Lewis肺癌移植瘤模型,用白藜芦醇(白藜芦醇组,n=6)和PBS(对照组,n=6)分别灌胃处理,测量肿瘤体积和重量;用流式细胞术检测小鼠体内各群MDSCs细胞比率;用免疫磁珠分选技术分离出荷瘤小鼠脾脏粒系MDSCs(G-MDSCs)及单核系MDSCs(M-MDSCs),经白藜芦醇分别刺激12 h后,流式细胞术检测G-MDSCs凋亡及M-MDSCs分化情况.结果:与对照组比较,白藜芦醇组荷瘤小鼠肿瘤体积显著减小(P<0.05),肿瘤重量减轻(P<0.01),脾脏中总MDSCs、M-MDSCs比率无明显变化,G-MDSCs比率下调;肿瘤组织中总MDSCs和G-MDSCs比率均显著减少(P均<0.05),M-MDSCs比率无显著差异.白藜芦醇分别处理G-MDSCs、M-MDSCs后,早期和晚期凋亡的G-MDSCs总数明显高于对照组,M-MDSCs表面CD11c和F4/80的表达显著上调.结论:白藜芦醇可通过促进G-MDSCs凋亡和M-MDSCs分化抑制肿瘤生长.
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羟氯喹促进ERK1/2磷酸化减轻大鼠脑缺血再灌注损伤
目的:探讨羟氯喹(hydroxychloroquine,HCQ)对大鼠脑缺血再灌注损伤(ischemia/reperfusion,I/R)的影响.方法:采用随机数字表法将健康雄性SD大鼠72只分为6组:对照组、缺血再灌注组(I/R组)、低剂量羟氯喹预处理组(HCQ250组)、中剂量羟氯喹预处理组(HCQ500组)、高剂量羟氯喹预处理组(HCQ1000组)和细胞外信号调节激酶1/2(extracellular regulated protein kinases 1/2,ERK1/2)抑制剂U0126预处理组(U0126组),每组均为12只.采用线栓法行短暂性大鼠大脑中动脉栓塞(middle cerebral artery occlusion,MCAO)建立大鼠缺血性脑卒中模型.I/R组行MCAO后2 h再灌注,HCQ250组、HCQ500组、HCQ1000组和U0126组分别在MCAO前72 h、48 h和24 h经侧脑室注射8μL 250、500、1000和1000μmol/L HCQ,其中U0126组在每次注射1000μmol/L HCQ后12 h再经侧脑室注射8μL 1000μmol/L U0126;对照组不栓塞大脑中动脉,其余处理同I/R组.再灌注6 h时将每组一半大鼠断头取脑,采用蛋白质印迹法检测缺血半暗带脑组织ERK1/2、p-ERK1/2、抗凋亡因子Bcl-2和促凋亡因子cleaved caspase-3、环磷腺苷效应元件结合蛋白(cAMP-response element binding protein,CREB)、磷酸化CREB(p-CREB)、蛋白激酶B(Akt)和磷酸化Akt(p-Akt)的表达;再灌注24 h时采用神经功能缺陷评分量表检测剩余大鼠的神经功能,再断头取脑后采用2％TTC染色测量脑梗死体积.结果:与对照组比较,其余5组神经功能缺陷评分显著降低,脑梗死体积明显增大,p-ERK1/2、cleaved caspase-3、p-CREB和p-Akt表达显著增高,Bcl-2表达降明显低(P均<0.05);与I/R组比较,HCQ250组、HCQ500组、HCQ1000组神经功能缺陷评分明显升高,脑梗死体积显著减少,p-ERK1/2、Bcl-2、p-CREB、p-Akt表达明显增高,cleaved caspase-3表达降低明显(P均<0.05);与HCQ1000组比较,U0126组神经功能缺陷评分明显降低,脑梗死体积显著增大,p-ERK1/2、Bcl-2、p-CREB和p-Akt表达降低显著,cleaved caspase-3表达明显增高(P均<0.05).结论:羟氯喹可能通过CREB/Akt信号通路促进p-ERK1/2表达,参与大鼠脑缺血再灌注损伤时的内源性保护机制.
关键词： 缺血再灌注损伤 羟氯喹 细胞外信号调节激酶 环磷腺苷效应元件结合蛋白 蛋白激酶B -
应用多鼠磁共振检查评价放射性软组织损伤的可行性
目的:探讨应用3.0T磁共振(MRI)同时检查多只小鼠评价放射性软组织损伤的可行性.方法:20只8周龄雄性C57BL/6小鼠随机分成对照组和照射组,每组均为10只.照射组应用6 MV X射线,单次照射小鼠右后肢30 Gy,对照组予以假照射.分别于照射前和照射后第7天进行3.0T MRI检查,每次同时检查5～6只小鼠.比较两组小鼠右后肢大腿肌肉的表观弥散系数(ADC)值和纵向弛豫时间(T1)值.结果:小鼠后肢MRI图像质量好,对比度高.照射前两组小鼠右后肢大腿肌肉的ADC值和T1值的差异均无统计学意义(P>0.05).照射后第7天照射组小鼠两侧后肢大腿肌肉的ADC值和T1值的差异亦均无统计学意义(P>0.05).照射后第7天对照组和照射组小鼠右后肢大腿肌肉的ADC值分别为(1.34±0.09)×10-3 mm2/s和(1.45±0.11)×10-3 mm2/s,差异有统计学意义(t=2.473,P=0.024);T1值分别为(1394.9±70.8)ms和(1514.9±110.5)ms,差异有统计学意义(t=2.890,P=0.010).结论:3.0T MRI同时检查多只小鼠应用于评价小鼠放射性软组织损伤简单、可行.
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间充质干细胞培养上清液抑制成纤维细胞的衰老
目的:探讨人脐带间充质干细胞培养上清液对人皮肤成纤维细胞的抗衰老作用.方法:将原代人皮肤成纤维细胞分为正常对照组、H2 O2组、培养上清液组和H2 O2+培养上清液组.其中,H2 O2组和H2 O2+培养上清液组中细胞皆采用200μmol/L H2 O2预先处理,以诱导细胞衰老模型.采用 β-半乳糖苷酶染色试剂盒检测细胞 β-半乳糖苷酶活性;DAPI染色检测细胞核体积变化;采用实时荧光定量PCR法(RT-qPCR)检测细胞中P53和P21的mR-NA转录水平;蛋白质印迹检测P53蛋白表达.结果:与正常对照组相比,H2 O2处理后与细胞衰老相关的 β-半乳糖苷酶活性明显增强、β-半乳糖苷酶阳性细胞百分比明显增多(P<0.05);细胞核体积明显变大,衰老细胞明显增多(P<0.05);P53和P21 mRNA转录水平明显升高(P<0.05),并且P53蛋白表达增强.经间充质干细胞培养上清液处理后,上述衰老相关指标均明显改善(P<0.05).结论:人脐带间充质干细胞培养上清液可抑制H2 O2诱导的成纤维细胞衰老进程.
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阴道毛滴虫巨噬细胞迁移抑制因子的原核表达 及多克隆抗体制备
目的:原核表达阴道毛滴虫巨噬细胞迁移抑制因子(macrophage migration inhibitory factor of Trichomonas vaginalis,TvMIF)并制备多克隆抗体.方法:采用PCR技术扩增TvMIF基因,并克隆至pTG19-T载体,酶切及测序鉴定后,再定向插入pET-30a(+)载体.将重组载体转化至大肠埃希菌BL21(DE3)中,用IPTG诱导蛋白表达.采用镍柱亲和层析法纯化TvMIF蛋白,并免疫新西兰白兔制备多克隆抗体,蛋白质印迹法检测多克隆抗体.结果:从阴道毛滴虫cDNA中扩增出TvMIF基因片段,测序结果与基因库收录序列一致.成功构建pET-30a-TvMIF重组质粒,重组TvMIF蛋白约为15.5 kDa,以可溶性蛋白形式存在.获得TvMIF重组蛋白的多克隆抗体,蛋白印迹法检出TvMIF的特异性条带.结论:成功获得阴道毛滴虫MIF蛋白并制备了多克隆抗体,可用于后续研究阴道毛滴虫致病机制.
关键词： 阴道毛滴虫 巨噬细胞迁移抑制因子 原核表达 多克隆抗体 -
3％巯基乙酸盐肉汤诱导法高效提取小鼠腹腔巨噬细胞
目的:比较不同方法提取小鼠腹腔巨噬细胞的生物学特性并筛选出高效的提取方法.方法:选取32只健康昆明小鼠,随机分为4组,每组8只,分别采用以下4种不同方法获得腹腔巨噬细胞:PBS直接灌洗小鼠腹腔(PBS组);含10％血清的RPMI 1640培养液注入小鼠腹腔,30 min后灌洗小鼠腹腔(培养液组);6％淀粉肉汤注入小鼠腹腔,每天1次,3 d后以PBS灌洗腹腔(淀粉肉汤组);3％巯基乙酸盐肉汤注入小鼠腹腔,每天1次,3 d后以PBS灌洗腹腔(巯基乙酸盐组);将各组所获细胞分别转入含10％血清的RPMI 1640培养基中贴壁培养,比较细胞形态、数量、吞噬能力、纯度以及活性.结果:4组巨噬细胞的形态无明显差异;与其他3组相比,巯基乙酸盐组诱导所得的细胞数量多(t=16.685,9.361,3.199,P均<0.01),且吞噬能力强(t=5.675,3.712,3.026,P均<0.01);4组巨噬细胞的F4/80、CD68表达率以及活性均相似且高于95％,差异无统计学意义(F=0.696,0.647,0.341,P均>0.05).结论:3％巯基乙酸盐肉汤诱导小鼠腹腔巨噬细胞后灌洗,是一种获取大量小鼠腹腔巨噬细胞的高效方法.
