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腺病毒载体RNA干扰抑制Fas(CD95)表达作用
目的:观察串联表达Fas-shRNA的腺病毒载体pAdeno-X-siFas 1+siFas 2对脂多糖(LPS)/D-氨基半乳糖(D-GalN)诱导BALB/c鼠肝细胞Fas过表达的影响.方法:20只雄性BALB/c鼠随机分为:RNA干扰组(RNAi组)、腺病毒通用阴性对照组(HK组)、模型组(M组)和正常对照组(N组).RNAi组于0 h、24 h经尾静脉注射腺病毒载体pAdeno-X-siFas 1+siFas 2两次,HK组尾静脉注射阴性腺病毒载体;M组尾静脉注射生理盐水;24 h后上述3组腹腔注射LPS/D-GalN;N组尾静脉和腹腔均注射生理盐水.注射LPS/D-GalN 8 h后,麻醉并处死鼠取肝脏,冰冻切片荧光显微镜检测腺病毒转染率;Western Blot检测各组肝细胞Fas 表达;RT-PCR检查Fas mRNA表达.结果:RNAi组和HK组腺病毒对肝细胞的转染率差异没有显著性(P=0.935);RNAi组与M组和HK组相比肝细胞Fas表达水平显著减少(P＜0.01),其Fas mRNA水平也明显降低(P＜0.01).结论:串联重组腺病毒载体能有效转染肝细胞并抑制LPS/D-GalN诱导的BALB/c鼠肝细胞Fas基因的过表达.
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RNAi沉默Fas受体表达的腺病毒载体构建
目的:利用pEGFP6-1和pGenesil-1质粒构建针对小鼠Fas的2个短发卡状RNA (short hairpin RNA,shRNA) 串联表达的载体pEGFP6-1-siFas1+siFas2,进一步通过BD Adeno-X系统构建腺病毒表达Fas-shRNA载体.方法:设计表达2个短发卡状RNA结构的互补DNA序列分别克隆至质粒载体pEGFP6-1和pGenesil-1中,酶切pEGFP6-1-siFas1大片段和酶切pGenesil-1-siFas2小片段,经T4 DNA Ligase连接得到pEGFP6-1-siFas1+siFas2重组质粒.双酶切重组质粒和pShuttle2穿梭质粒,经T4 DNA连接酶连接得到pShuttle2-siFas1+siFas2质粒.双酶切重组穿梭质粒,连接酶切产物和腺病毒转化感受态E.coil DH5а,PCR筛选鉴定阳性克隆,进一步线性化重组腺病毒pAdeno-siFas1+siFas2质粒,经脂质体转染HEK 293A细胞;收细胞进行裂解收病毒. 结果:构建的重组质粒载体经酶切鉴定和测序分析,shRNA编码序列与设计的片段完全一致;重组腺病毒载体经酶切鉴定和PCR分析正确;经HEK293A细胞包装成功,能够表达绿色荧光蛋白.结论:成功构建Fas-shRNA腺病毒串联表达载体.
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基于大鼠模型的骨髓CD34+、Fas(CD95)、TNF-α与再生障碍性贫血中医辨证分型关系的研究
目的:探讨再生障碍性贫血(aplastic anermia,AA)大鼠模型的骨髓中凋亡因子CD34+、Fas(CD95)、TNF-α表达与中医证型的关系.方法:将60只Wistar雄性大鼠随机分为正常组、模型组、心脾两虚组、脾肾阳虚组、肝肾阴虚组,每组12只.采用马利兰丙酮提取液腹腔注射制备大鼠AA模型,然后按相关文献方法加重模型大鼠的心脾两虚、脾肾阳虚、肝肾阴虚症状.检测各组大鼠的白细胞(WBC)、红细胞(RBC)、血小板(PLT)、血红蛋白(Hb)水平及其骨髓CD34+、Fas、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)表达情况.结果:①与正常组比较,其余各组大鼠的Hb、RBC、WBC 、PLT水平均显著降低(P＜0.05),提示造模成功;与模型组比较,肝肾阴虚组大鼠的Hb、RBC、WBC、PLT水平降低更加显著(P＜0.05).②与正常组比较,其余各组大鼠的骨髓CD34+表达均明显下调(P＜0.05),Fas、TNF-α表达明显上调(P＜0.05);与模型组比较,肝肾阴虚组大鼠的骨髓CD34+下调更加显著(P＜0.05),Fas、TNF-α表达上调更加显著(P＜0.05).结论:肝肾阴虚型再生障碍性贫血大鼠的病情更加严重,这与临床中再生障碍性贫血"阳虚易治,阴虚难调"的理论基本一致,同时也为再障的中医辨证分型提供了一定的客观化依据.
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乙肝相关性肝硬化、肝癌患者外周血淋巴细胞Fas及其mRNA的表达
目的 探讨乙型肝炎(简称乙肝)相关性肝硬化和肝癌患者外周血淋巴细胞Fas及Fas mRNA表达水平以及血清中可溶性Fas(sFas)水平与疾病发生的关系.方法 选择临床确诊的慢性乙肝患者20例、乙肝相关性肝硬化患者28例、HBV相关性肝癌患者20例以及健康对照者20例,分别采用流式细胞术和RT-PCR检测外周血淋巴细胞Fas及其mRNA水平.采用ELISA双抗体夹心法检测血清中sFas的水平.结果 以上各组外周血淋巴细胞Fas水平分别为(49.6±10.8)%、(43.0±9.1)%、(70.4±7.02)%和(59.9±4.02)%.Fas mRNA表达水平分别为1.22±0.19、1.20±0.16、1.74±0.17和1.50±0.10,肝癌组外周血淋巴细胞Fas及其mRNA表达水平均明显高于对照组(P＜0.05),而慢性乙肝和乙肝相关性肝硬化组均明显低于对照组(P＜0.05).各组血清sFas水平分别为(2.06±0.98)μg/L、(3.18±1.60)μg/L、(2.23±1.12)μg/L和(1.11±0.49)μg/L.与对照组比较,其他三组均明显升高(P＜0.05).结论 外周血淋巴细胞Fas及其mRNA水平的高低和血清中sFas水平的变化可能与乙肝相关性肝硬化、肝癌的发生有一定的关系.
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腺病毒载体RNAi技术抑制血吸虫病小鼠肝细胞Fas表达
目的 探讨RNAi技术对血吸虫病肝组织中Fas表达的作用.方法 采用尾静脉注射腺病毒载体,在小鼠体内表达Fas-shRNA抑制血吸虫病小鼠肝细胞Fas的表达.冰冻切片荧光显微镜检查腺病毒载体对肝细胞的转染率,免疫组化和Western Blot方法检测肝组织Fas表达情况,RT-PCR方法检测肝组织Fas mRNA表达情况.结果 免疫组化和Western Blot方法检测均表明RNAi组Fas表达受到抑制(t=29.799,P＜0.01),模型组和HK对照组Fas表达增强.对Fas mRNA表达的RT-PCR方法检测也与上述结果一致.腺病毒载体对肝细胞的转染率达78.5%.结论 腺病毒载体Fas-shRNA能够有效抑制血吸虫病小鼠肝细胞Fas的表达,尾静脉注射腺病毒载体能高效率感染肝细胞.
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哮喘儿童外周血T淋巴细胞Fas/FasL的表达及其意义
目的 探讨哮喘儿童外周血T淋巴细胞Fas、FasL表达及其意义.方法 21例哮喘发作期患儿、15例哮喘缓解期患儿及25例正常儿童作为研究对象;密度梯度法分离外周血淋巴细胞;免疫荧光抗体法检测淋巴细胞Fas、FasL表达阳性率;用t检验和直线相关分析进行资料统计处理.结果 发作期惠儿淋巴细胞Fas表达明显下降,与正常对照组和缓解期患儿组比较差异均有非常显著意义(t=5.914 2,3.1084,P<0.01);缓解期患儿淋巴细胞Fas表达比发作期患儿有明显提高,但与正常组相比仍有显著降低(t=2.338 8,P<0.05);淋巴细胞FasL表达总体均较低,但在发作期患儿仍明显高于正常对照组(t:2.186 1,P<0.05),在缓解期患儿FasL表达虽高于正常对照组,但无统计学意义(t=1.772 4,P>0.05);发作期患儿外周血中表达Fas的淋巴细胞阳性率与淋巴细胞比率呈明显的负相关(r=-0.632,P<0.05),而表达FasL的淋巴细胞阳性率与淋巴细胞比率间无明显相关性.结论 哮喘发作期和缓解期儿童存在淋巴细胞凋亡下降,这可能是哮喘患儿气道慢性炎症持续存在的原因;同时提示在缓解期患儿仍需继续维持治疗.
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人急性白血病细胞中Fas(CD95)的表达及其功能
目的:研究急性白血病细胞中Fas的定性和定量表达及功能.方法:应用流式细胞术及RT-PCR方法检测急性白血病患者外周血或骨髓中白血病细胞的Fas定性和定量表达,并用AnnexinV染色法检测其功能.结果:急性白血病细胞中Fas蛋白呈单峰状表达,具有不同的密度,并且在不同类型细胞中表现出不同的定量特征;Fas呈定性阴性或定量弱表达的患者中,其全长和剪接体mRNA的表达水平与蛋白的表达水平有关;新分离出来的白血病细胞在体外与pokeweed(PWA)抗原共同培养后,可引起Fas表达水平的上调;新鲜的急性淋巴细胞白血病(ALL)和急性髓系白血病(AML)细胞对于抗FasIgM抗体有抵抗能力,而鬼臼乙叉苷(etoposide,ETP)能够引起所有类型的急性白血病细胞产生凋亡.抗FasIgM抗体和ETP的联合使用并不能产生协同效果.结论:Fas是ALL和AML细胞的一个生物学标志,该研究为探讨细胞毒素制剂和细胞因子治疗作用的机制提供了线索.
