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RNF146真核表达载体的构建及其对非小细胞肺癌细胞系生物学行为的影响
目的：构建 E3泛素连接酶环指蛋白146（RNF146）基因真核表达载体，研究 RNF146对非小细胞肺癌细胞系体外生物学行为的影响。方法采用反转录-聚合酶链反应（RT-PCR）和蛋白印迹法筛选 RNF146低表达细胞系。构建 pEX4-RNF146真核表达载体，经酶切和测序后瞬时转染 LTE 细胞，荧光显微镜观察、蛋白印迹法检测转染效率。四甲基偶氮唑盐（MTT）比色实验检测肿瘤细胞体外增殖能力，划痕实验评价肿瘤细胞体外迁移能力，Buyden 小室实验检测肿瘤细胞体外侵袭能力。结果酶切和基因测序证实重组质粒 pEX4构建正确。MTT 比色实验显示转染 pEX4-RNF146组细胞增殖速度明显高于转染空载体组和未转染组（P ＜0.05）。划痕实验显示转染组细胞24 h 迁移率明显高于空载体组和未转染组（P ＜0.05）。Buyden 小室实验结果表明转染组比空载体组和未转染组穿膜数目明显增多（P ＜0.05）。结论RNF146基因转染能促进非小细胞肺癌 LTE 细胞的体外增殖、迁移和侵袭能力，可能是一个潜在的促肿瘤增殖、侵袭和转移的相关基因。
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非小细胞肺癌中过表达RNF146对Axin和β-catenin表达和定位的影响
目的:观察E3泛素连接酶RNF146表达对Axin和β-catenin蛋白表达的影响,探讨RNF146与Wnt/β-catenin信号通路在非小细胞肺癌(NSCLC)发生发展中的作用.方法:应用免疫组织化学EnVision法检测133例NSCLC患者肺癌中RNF146、Axin和β-catenin的表达.构建RNF146过表达质粒,应用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)、Western blot和细胞免疫荧光方法研究RNF146在肺癌细胞株A549和LTE中过表达对Axin和β-catenin表达及定位的影响.结果:NSCLC患者肺癌组织中RNF146高表达72例(54.1％)中49例(68.1％)显示Axin表达减弱或缺失,19例(26.4％)出现β-catenin细胞核阳性表达;RNF146低表达61例(45.9％)中只有26例(42.6％)显示Axin表达减弱或缺失,7(11.5％)例出现β-catenin细胞核阳性.RNF146与Axin的表达呈明显的负相关(P=0.003),与β-catenin的细胞核表达呈正相关(P =0.047).肺癌细胞系中过表达RNF146能够下调Axin蛋白的表达,诱导β-catenin蛋白表达和核内分布,但对Axin和β-catenin mRNA水平没有影响.结论:RNF146可能通过Wnt/β-catenin通路参与肺癌的发生发展.
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shRNA沉默环指蛋白146基因对非小细胞肺癌细胞迁移、侵袭及其相关蛋白表达的影响
目的：shRNA沉默环指蛋白146（RNF146）基因，观察非小细胞肺癌细胞中RNF146沉默对肺癌细胞迁移和侵袭及其相关蛋白表达的影响。方法：逆转录聚合酶链反应（ RT-PCR）和Western blot方法用于筛选RNF146高表达肺癌细胞系。构建shRNA-RNF146真核表达载体，瞬时转染A549和H1299肺癌细胞，West-ern blot检测转染效率。划痕实验评价肺癌细胞体外迁移能力；Buyden小室实验检测肺癌细胞体外侵袭能力。Western blot检测肺癌细胞中迁移和侵袭相关蛋白的表达。结果：RT-PCR和Western blot方法筛选RNF146高表达肺癌细胞系，显示 A549和 H1299细胞中 RNF146蛋白均高于其它细胞系。shRNA -RNF146转染A549和H1299细胞系后，划痕实验显示转染组细胞24小时迁移率明显低于空载体组和未转染组（ P＜0.01）。Buyden小室实验结果表明转染组比空载体组和未转染组穿膜细胞数目明显减少（ P＜0.05）。West-ern blot检测与细胞迁移和侵袭相关的调控蛋白（ MMP2、MMP7、MMP9、RhoA、RhoB、RhoC、Rock1、TIMP-1等）的表达情况，结果显示干扰 RNF146后 A549细胞中 MMP2和 MMP7表达明显减少，而 MMP9、RhoA、RhoB、RhoC、Rock1、TIMP-1等蛋白的表达变化不明显。结论：RNF146可能通过调控MMP2和MMP7的蛋白水平促进肺癌细胞迁移和侵袭。
