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大豆脱水应答元件结合蛋白(GmDREB1)的非融合原核表达及纯化
目的 大豆脱水应答元件结合蛋白(GmDREB1转录因子)基因是应用于转基因小麦中增强其耐旱、盐碱的基因,本研究拟探索获得与天然蛋白GmDREB1一致的蛋白表达纯化方法,以获得足量的蛋白纯品,为该外源蛋白的安全性评价奠定基础.方法 将GmDREB1基因克隆到原核表达载体pBV220中,构建重组表达载体pBV220-GmDREB1,转化E.coli DH5a进行诱导表达,通过优化GmDREB1基因密码子、改善诱导表达条件及选择合适的表达载体等实现目的蛋白的高效表达,对表达产物进行阳离子交换和分子筛等层析纯化,对获得的纯化蛋白进行序列、活性及免疫原性等测定.结果 含序列优化目的基因的重组载体pBV220-GmDREB1转化E.coliDH5a后,经42℃诱导表达2小时,获得了以可溶性为主的GmDREB1蛋白,经层析纯化获得了与天然目的蛋白一致的蛋白纯品.结论 利用本研究方法可得到在N端序列、活性及免疫原性等方面与天然GmDREB1蛋白一致的目的蛋白.
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重组恶性疟多表位杂合蛋白在大肠杆菌中的表达
将化学合成的恶性疟原虫保护性抗原复合基因(HGFSP)与表达载体pRSET重组并转化大肠杆菌BL21,工程菌经IPTG诱导后,HGFSP得到高效表达.SDS-PAGE结果显示表达产物以非融合、可溶性的形式表达,分子量为23 kDa,占总菌体蛋白的23.65%.Dot-ELISA和Western-blot分析表明表达产物具有免疫原性.
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RTA和RTA-KEEL/KDEL基因的表达及细胞毒性
目的 构建蓖麻毒素A链(RTA)和RTA-KEEL/KDEL基因表达载体,并检测重组蛋白的细胞毒性作用.方法 用PeR法从蓖麻毒素基因组中扩增出RTA及RTA-KEEL/KDEL基因,连接T载体,测序正确后,定向插入质粒pET-28a(+)中,构建重组表达质粒pET-28a-RTA和pET-28a-RTA-KEEL/KDEL,转化感受态E. coli BL21(DE3),IPTG诱导表达,并对表达产物进行鉴定.结果 所表达的RTA及RTA-KEEL/KDEL非融合蛋白经SDS-PAGE分析,相对分子质量约为31 000,Westernblot分析具有反应原性,MTS法检测,RTA-KEEL/KDEL对CHO细胞具有比RTA更强的杀伤作用.结论 已成功构建RTA和RTA-KEEL/KDEL表达载体,表达的重组蛋白具有生物学活性.
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非融合rIL-24蛋白的制备及活性鉴定
目的 制备非融合的rIL-24蛋白,鉴定其体外诱导肿瘤细胞凋亡活性.方法 为制备非融合IL-24蛋白,将IL-24基因插入到pET32a(+)上KpnⅠ与BamHⅠ之间,构建表达载体IL-24/pET32a,IPTG诱导在E.coli BL21(DE3)中表达.洗涤后的包涵体溶解在2 mol/L 尿素(pH 9.0)中,采用镍离子亲和色谱和凝胶分子筛的二步法纯化,肠激酶酶切(肠激酶与蛋白1:400,pH 7.5处理36 h),再用亲和柱色谱纯化制备非融合的rIL-24.MTT法和形态学观察分析rIL-24体外诱导肿瘤细胞凋亡的活性.结果 重组工程菌以包涵体形式表达出相对分子质量约为35 000的融合蛋白.包涵体经洗涤、溶解及二步纯化得到纯度大于95%的Trx-IL-24.融合蛋白用肠激酶酶切之后,经亲和色谱制备得到纯度大于98%的非融合蛋白rIL-24.rIL-24显著诱导MCF-7乳腺癌细胞凋亡(P<0.05),而对正常人肺成纤维细胞NHLF没有影响.结论 IL-24基因在E.coli中高效表达,并获得高纯度、在体外明显诱导乳腺癌细胞凋亡的非融合蛋白rIL-24,预示其具有肿瘤治疗应用的前景.
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prk基因非融合表达载体的构建及其在大肠杆菌中的表达
目的:构建prk基因的非融合表达载体,并诱导表达.方法:PCR扩增并回收prk基因片段,将其与亚克隆载体pMDl8-T重组,通过蓝/白斑筛选、酶谱分析和序列测定鉴定出重组质粒,然后从该重组质粒上切下prk基因片段,再克隆至非融合表达载体pBV220中,酶谱分析鉴定出正向重组质粒,诱导含有正向重组质粒的宿主菌表达蛋白,提取全菌总蛋白进行聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分析.结果:成功构建并筛选出pBV220正向重组质粒,经热诱导表达,得到一可溶性的相对分子质量为65 ku的重组蛋白.结论:pBV220-prk表达载体的成功构建和表达,说明扩增所得的基因具有正确的阅读框架,使获得天然Prk蛋白成为可能,为进一步研究prk基因的生物学功能奠定了基础.
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人工合成人表皮生长因子在大肠杆菌中的表达
目的:在大肠杆菌中高效表达人表皮生长因子(hEGF), 并探索提高外源基因在pE T-3c:BL(DE3)表达系统的表达水平的途径.方法:根据大肠杆菌对密码的偏爱性, 合成编码53个氨基酸的hEGF基因,分别以非融合蛋白和融合蛋白两种方式表达.计算机分析两者mRNA的翻译起始区(translation initiation region,TIR)的结构.结果 :融合蛋白表达产量为27%,非融合蛋白的表达用SDS-PAGE检测不到,两者均具有促细胞增殖的活性. 融合蛋白mRNA的TIR的ΔG值较非融合蛋白的高.结论:在pET-3c:BL21(D E3)大肠杆菌表达系统中,以融合蛋白方式表达人表皮生长因子,表达效率高且不影响其活性.此外,mRNA 的TIR的结构可能是影响外源基因在本研究的表达系统的表达效率的一个重要因素.
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恶性疟原虫多表位重组疫苗在大肠杆菌中的表达及纯化
目的在体外表达和纯化目的蛋白,为下一步抗攻击试验提供安全有效的产品.方法将化学合成的恶性疟原虫保护性抗原复合基因(HGFSP)与表达载体pRSET重组,在大肠杆菌BL21进行表达:工程菌经超声破菌、离心、离子交换层析、疏水层析、分子筛层析等步骤纯化.结果 SDS-PAGE显示表达产物以非融合、可溶性的形式表达,相对分子质量为23 kDa,占总菌体蛋白的23.65%;纯度可达95%以上.Western-blot分析表明表达产物具有免疫原性.结论成功构建pRSET-HGFSP重组表达系统并得到高效表达,纯化工艺令人满意.
