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病原真菌DNA提取方法及简单重复序列聚合酶链反应体系的优化
背景:真菌DNA的提取在真菌基因工程以及分子生物学研究中占有重要地位.DNA的提取效率,尤其是DNA的质量严重影响实验结果.目的:建立提取病原真菌基因组DNA的方法,探讨简单重复序列-PCR反应体系中各成分的佳组合.设计、时间及地点:DNA提取方法对照分析及正交实验,于2004-06,2006-12在吉林大学白求恩医学院病原生物学教研室真菌学研究室进行.材料:将接种临床标本的马铃薯葡萄糖液体培养基、马铃薯葡萄糖琼脂培养基、酵母蛋白胨液体培养基28℃培养3-7 d后,选取可疑菌落进行分离、纯化.方法:比较玻璃珠-盐析法、CTAB法、GeneTLE~(TM)抽提法3种不同DNA提取方法对菌体DNA质量的影响;利用正交设计,选择Taq DNA聚合酶、模板DNA、dNTP、引物4个因素,在3个水平上根据L9(3~4)正交表进行试验,对真菌简单重复序列-PCR(SSR-PCR)体系进行优化分析;并通过PCR选择适宜的退火温度及循环次数.主要观察指标:根据扩增获得带型的多态性和特异性,确定佳反应体系.结果:Gene TLE~(TM)抽提法全部在相应的PCR体系中扩增出目的片段,且带型清楚度、明亮度优于其余两种方法.SSR-PCR反应体系正交试验结果显示,根据尺值大小确定因素显著性顺序为模板DNA(2.67)>Taq DNA聚合酶(2.00)>dNTP(0.67)>引物(0.33);根据ki值大小确定各因素优化水平组合为:模板DNA 30 mg/L,Taq DNA聚合酶1 U,dNTP150 μmol/L,引物0.5 μmol/L.但由于引物作为影响因素的R值小,是非显著因素,因此引物取A水平即0.25 μmol/L.反应条件以53℃退火温度、35个循环次数为佳.结论:Gene TLE~(TM)提取法提取DNA的效率更高、操作步骤快速简单.根据正交试验的优化结果,SSR-PCR佳反应体系为模板DNA 30 mg/L,Taq DNA聚合酶1 U,dNTP 150 μmol/L,引物0.25 μmol/L.反应条件以53℃退火温度、35个循环次数为佳.
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SSR-PCR和常规PCR检测不同地区并殖吸虫遗专变异的比较研究
目的 以SSR-PCR和常规PCR对浙江省和福建省5个不同地区并殖吸虫进行遗传变异检测,比较两者对并殖吸虫的基因水平分类的差异.方法 采用微卫星锚定PCR (SSR-PCR)对基因组DNA进行PCR扩增,扩增产物按Nei的方法计算遗传距离,并应用SPSS软件构建系统进化树；采用常规PCR扩增线粒体细胞色素C氧化酶亚单位(C()I)及核糖体DNA第二间区(ITS2)的基因序列,测序后用BoiEdit软件分析同源性,用MEGA软件构建种系发生树.结果 不同地区并殖吸虫标本的SSR-PCR产物呈多态性,浙江金华、浙江永嘉、福建周宁与福建平和、福建政和的标本存在明显的差异.前两者的遗传距离近,为0.3333,浙江金华与福建平和的标本遗传距离远,为0.8667.常规PCR基因序列分析显示浙江金华、浙江永嘉、福建周宁的标本之间在种系发生树上比较接近,浙江金华和浙江永嘉的标本为接近.结论 利用SSR-PCR和常规PCR进行并殖吸虫的遗传变异分析结果基本一致.SSR-PCR是一种比常规PCR更方便的并殖吸虫遗传变异研究方法.
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用SSR-PCR和RAPD技术研究中国不同地域旋毛虫株的遗传变异
目的对中国不同地域的旋毛虫株基因组DNA进行多态性分析,并为其种及种下分类提供依据.方法采用微卫星锚定PCR(SSR-PCR)及随机扩增多态性DNA技术(RAPD)对我国6旋毛虫株基因组DNA进行PCR扩增,根据扩增产物电泳条带情况进行SAS分析,计算遗传距离并构建进化树.结果 T3、T7与国内各地域株间遗传距离均大于0.85;湖北株与天津株、黑龙江株与云南株之间的遗传距离均小于0.2.河南株与前4株的遗传距离在SSR-PCR小于0.3,在RAPD小于0.6.结论中国6株旋毛虫在基因水平可分为不同层次的3类:a.湖北株、天津株为一类;b.黑龙江株、云南株为一类;c.不明株与河南株归为一类或者不明株归为a类中.国内6株归属于T1.此外,国际标准株T3、T7分为另两大类.
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微卫星锚定PCR研究日本血吸虫的遗传变异
目的对中国不同自然隔离群的日本血吸虫进行遗传变异研究,并为中国日本血吸虫地域品系的划分提供依据.方法采用微卫星锚定PCR(SSR-PCR)技术对中国7省10地日本血吸虫标本基因组DNA进行PCR扩增,根据扩增产物,计算遗传距离,并构建系统进化树.结果各地域标本PCR扩增产物均呈多态性,其中中国大陆与中国台湾日本血吸虫之间的遗传距离为0.316±0.067(0.176～0.378);中国大陆日本血吸虫山区型之间的遗传距离为0.067;湖区型之间的遗传距离为0.063～0.176;山区型与湖区型之间的遗传距离为0.067～0.250;湖北省境内4个地域的日本血吸虫,其遗传距离为0.063～0.111.结论根据我们所采集的日本血吸虫标本和SSR-PCR的实验结果,认为中国大陆日本血吸虫在基因分类水平上至少可分为不同层次的5类:①云南洱源、四川天全为一类;②安徽贵池、湖南岳阳为一类;③湖北武汉、湖北钟祥为一类;④江西新建、湖北阳新为一类;⑤湖北松滋单独为一类.其中①与②③④⑤在总体上可分为两大类,②③④⑤又可再分为②③与④⑤两类,②③与④⑤还可再各分为两类,此外,中国台湾日本血吸虫单独列为一类.
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药用甘草SSR-PCR反应体系的优化与引物筛选
目的 为了有效地确定甘草SSR-PCR反应体系,进一步筛选具有多态性的甘草SSR引物.方法 采用正交设计试验L16 (45)结果 建立了适合甘草SSR-PCR反应的佳体系,20μl体系中各组分的浓度分别为:2.0 μl 10×Buffer,Mg2+浓度为1.0 mmol/L模板DNA浓度30 ng/20 μl,dNTPs浓度为0.15 mmol/L,引物浓为0.3 μmol/L,Taq DNA聚合酶用量为1.0 U/20 μl.利用优化体系对69对SSR引物进行了筛选,共筛选出33对在4种药用甘草中均能有效扩增且多态性较好的SSR引物.结论 该研究为利用SSR标记对甘草属植物的遗传多样性分析、分子辅助育种、指纹图谱构建和物种鉴定及野生资源保护等工作提供技术支撑.
