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关于阿尔茨海默病的机制研究:Mint2基因在 PC12细胞中的表达功能及其作用的初步研究
目的:获得高表达 Mint2蛋白的 PC12稳定表达株,观察 Mint2蛋白对 PC12细胞形态的影响,深入研究阿尔茨海默病的发病机制. 方法:用 PCR方法将 Mint2基因亚克隆至真核表达载体 pcDNA3.1A,构建真核表达载体 pcDNA3.1-AMint2;采用脂质体 lipofectamine2000介导,将重组载体转染入 PC12细胞, G418筛选稳定克隆;用 RT-PCR和 Westernblot检测外源基因 Mint2在 PC12细胞中的转录及表达,并观察 Mint2蛋白对 PC12细胞形态的影响. 结果:成功构建了真核表达载体 pcDNA3.1-Mint2;并获得了稳定表达 Mint2蛋白的 PC12- Mint2基因工程细胞株; Mint2对 PC12细胞具有明显的促分化和促胞体增大的神经营养作用. 结论:Mint2可在 PC12细胞中有效表达,目对 PC12细胞形态有明显影响,这为进一步研究 Mint2生物学功能及其作用机制奠定了基础.
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PC12-Mint2基因工程细胞株的构建
目的:构建稳定表达Mint2蛋白的PC12-Mint2基因工程细胞株.方法:用PCR方法将Mint2基因亚克隆至真核表达载体pcDNA3.1A,构建真核表达质粒pcDNA3.1A-Mint2;采用脂质体Lipofectamine2000介导,将重组载体转染入PC12细胞,G418筛选抗性克隆,有血清培养并传代具有G418抗性的细胞,数代培养后获得工程细胞株;分别提取野生型PC12细胞和PC12-Mint2工程细胞的mRNA及细胞裂解液,RT-PCR方法检测Mint2基因是否整合入PC12细胞基因组,并用Western印迹法检测外源基因Mint2在PC12-Mint2工程细胞中是否正常表达.结果:扩增出的基因片段大小为2 253 bp;pcDNA3.1A-Mint2重组质粒酶切结果表明Mint2基因正确地插入到pcDNA3.1A载体中,测序结果正确;将pcDNA3.1A-Mint2转染PC12细胞,经G418筛选获得PC12-Mint2工程细胞株;RT-PCR结果表明Mint2基因已整合入PC12细胞,Western印迹结果显示在120 000处有特异条带,大小与Mint2蛋白理论计算值一致,表明在PC12-Mint2基因工程细胞中确实有Mint2蛋白表达.结论:本试验成功构建了真核表达质粒pcDNA3.1-Mint2,并获得了稳定表达Mint2蛋白的PC12-Mint2基因工程细胞株,为进一步研究Mint2生物学功能及其作用机制奠定了基础.
关键词： 基因亚克隆 Mint2 PC12细胞 转染 Western印迹法
