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大鼠骨髓间充质干细胞体外增殖与多向分化的能力
背景:生理条件下机体内多数骨髓间充质干细胞增殖并不明显,然而在一定刺激下可表现出旺盛的有丝分裂活动,具有很强的增殖倍增能力,且体外实验表明其具有多向分化潜能.目的:进一步验证体外分离培养的大鼠骨髓间充质干细胞生长增殖与多向分化潜能.方法:全骨髓法体外分离培养大鼠骨髓间充质干细胞,贴壁筛选法进行纯化,倒置相差显微镜下观察细胞形态及生长特征,MTT法绘制细胞生长曲线,免疫组化法对细胞表面干细胞标志CD44进行鉴定.取传至第4代细胞,分别用成骨、成软骨、成脂肪和成神经诱导剂予以培养,通过碱性磷酸酶染色、Ⅱ型胶原免疫组化染色、油红O染色、NeuN抗体免疫组化染色进行分化能力鉴定.结果与结论:分离培养的细胞呈长梭形或多边形,细胞生长曲线呈S形,群体倍增时间约为31 h,免疫细胞化学染色后CD44呈阳性表达,CD34呈阴性.第4代骨髓间充质干细胞成骨诱导2周后出现钙盐沉积,成软骨诱导培养2周后Ⅱ型胶原检测呈阳性,成脂肪诱导培养2周后在细胞的胞浆内充满大量红色脂肪滴,成神经诱导6 h后细胞出现突起,类似神经元的轴突和树突纤维,NeuN免疫组化染色呈阳性.表明体外培养的大鼠骨髓间充质干细胞生长增殖能力旺盛,可向成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞、神经元样细胞方向分化.
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全骨髓贴壁法分离培养大鼠骨髓间充质干细胞及其生物学特性
背景:培养出生长状态良好、数量足够多的大鼠骨髓间充质干细胞是其作为种子细胞在组织工程等领域广泛应用的重要前提.目的:寻求快捷有效的大鼠骨髓间充质干细胞体外培养条件,观察培养的间充质干细胞生物学特性.方法:全骨髓法体外分离培养大鼠骨髓间充质干细胞,贴壁筛选法进行纯化,倒置相差显微镜下观察细胞形态及生长特征,免疫荧光分析细胞骨架,MTT法绘制细胞生长曲线,流式细胞仪检测其表面标记.结果与结论:分离培养的细胞呈长梭形或多边形;细胞生长曲线呈S形;微丝免疫荧光染色结果显示,培养的骨髓间充质干细胞具有良好的细胞骨架系统.第3代骨髓间充质干细胞CD29、CD44、CD71、CD90均呈阳性表达,而CD13、CD34、CD45、CD133呈阴性.提示,经全骨髓贴壁法体外分离培养的细胞在形态学和细胞表面标志物表达方面具有干细胞生物学特性,经鉴定为骨髓间充质干细胞,其第3代活性佳,可用于后续实验.
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大鼠骨髓基质细胞的培养
目的：探讨骨髓基质细胞的分离、体外培养方法，观察骨髓基质细胞的形态。方法：从SD大鼠中分离骨髓基质细胞，采用密度梯度离心法结合贴壁筛选法将分离的骨髓基质细胞体外扩增，倒置显微镜下观察细胞形态学特征。结果：倒置相差显微镜观察发现，接种后24 h内细胞开始贴壁，贴壁细胞呈梭形或扁平形。48 h后贴壁细胞沿培养瓶壁伸展开，圆形，折光性强，细胞壁完整，胞核隐约可见，胞质丰富。传至第5代MSCs纯度高，增殖能力旺盛，呈梭形或纺锤形的细胞，呈漩涡状、菊花状排列生长。结论：骨髓基质细胞可通过体外培养纯化获得，传至第5代的骨髓基质细胞纯度高，密度梯度离心法结合贴壁筛选法可作为是一种较理想的骨髓基质细胞培养方法。
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密度梯度法与羟乙基淀粉法培养脐血间充质干细胞比较
目的 比较密度梯度离心法与羟乙基淀粉法体外分离培养脐血间充质细胞(hUCB-MSCs)的成功率,为今后细胞移植和基因治疗提供重要的细胞来源.方法 取44份足月儿顺产或剖宫产脐带血,分为两组,每组22份,分别用密度梯度离心法结合贴壁法与羟乙基淀粉法分离脐血中单个核细胞,专用培养基培养,观察两种方法培养所得细胞的形态变化并绘制生长曲线,用流式细胞术鉴定细胞表面标志物CD14,CD29,CD44,CD45,CD105的表达.结果 羟乙基淀粉法培养hUCB-MSCs的成功率(36.36％)高于密度梯度离心法结合贴壁法的培养成功率(9.1％)(P＜0.05).两种方法所得细胞在形态、生长曲线和表面标志物CD14,CD29,CD44,CD45,CD105的表达无明显差异(P＞0.05).结论 羟乙基淀粉法可以提高hUCB-MSCs培养成功率,为hUCB-MSCs在临床中应用奠定基础.
