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2,2-二甲基-1,3-二氧戊环-4,5-二羧酸衍生物的设计、合成及其神经营养活性
目的 设计并合成具有神经营养活性的小分子化合物.方法 根据FKBPs家族蛋白活性位点在序列和构象上高度保守的特点以及FKBP12配体的关键结构特征,设计并合成新结构的FKBPs配体.应用鸡胚背根神经节体外无血清培养模型和H2O2损伤NG108-15细胞模型对新结构的FKBPs配体的神经营养活性进行评价.结果与结论 合成了27个2,2-二甲基-1,3-二氧戊环-4,5-二羧酸衍生物.初步药理实验结果显示化合物7d对H2O2损伤NG108细胞有明显的保护效果;化合物7o具有一定的促神经生长作用.
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二烯丙基二硫抑制SW480细胞系生长增殖的相关蛋白质分子鉴定
目的 应用前期比较蛋白质组学筛出的部分差异表达蛋白质分子,进行进一步分析与鉴定.方法 采用MTT法,观察不同浓度和作用时间DADS对SW480细胞的生长抑制作用;使用流式细胞仪,分析50 mg·L-1 DADS对SW480细胞的周期分布的影响;运用Western blot方法,分析50 mg·L-1 DADS处理SW480细胞系后泛肽和FKBP的表达水平.结果 MTT法显示,DADS能明显抑制SW480细胞系生长增殖,呈浓度和时间依赖性,SW480细胞系经不同浓度DADS处理后,生长增殖速度明显减慢.流式细胞仪分析结果显示,50 mg·L-1 DADS将SW480细胞阻滞在G2/M期.应用Western blot分析结果显示,50 mg·L-1 DADS处理SW480细胞48 h,泛肽表达较对照组增强,而FKBP的表达明显降低,差异均为2倍以上.结果 DADS抑制SW480细胞系生长增殖,可能与泛肽表达上调,FKBP表达下调,将细胞阻滞在G2/M期有关.
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FKBP52在重组腺相关病毒载体胞内转运中的作用研究
目的 探讨细胞质中FKBP52对重组腺相关病毒(AAV)介导的基因转导效率的作用.方法 测定AAV在FKBP52-野生型(WT)、FKBP52-杂合型(HE)及FKBP52-基因敲除(KO)鼠胚纤维母细胞(MEFs)中的基因转导效率,观察羟基脲(HU)对不同基因型MEFs中AAV转导效率的影响.采用流式细胞术、EMSA、Southern blot、免疫沉淀、Western blot等方法分析FKBP52对AAV在细胞内转运的作用.结果 传统的单链AAV不能有效地转导FKBP52-WTMEFs,在FKBP52-HE及FKBP52-KO MEFs中的转导效率也未见明显增加.在这些细胞中,AAV不能有效地转运至细胞核.HU处理后能使AAV在WT MEFs中的转导效率提高25倍,但是在KO MEFs中AAV转导效率仅提高4倍.为避免AAV第二链合成的影响,进一步采用自身互补的AAV(scAAV)载体进行研究,结果 发现,HU能使WT MEFsscAAV基因转导效率增强23倍,但在KO MEFs中转导效率仅增加4倍.提示,HU处理后KO MEFs中转导效率未增加的原因并非由于AAV第二链的合成障碍所致.HU处理后,59%的AAV基因组DNA出现在WT MEFs细胞核,KOMEFs细胞核中为28%,提示HU介导的AAV转运通路在KO MEFs中存在缺陷.转染FKBP52表达质粒的KO MEFs经HU处理后,AAV所介导的基因转导效率恢复至WTMEFs的水平,且直接与其转运至细胞核的转运功能改善相吻合.结论 作为一种细胞分子伴侣蛋白,FKBP52能促进AAV在细胞内转运,有益于重组AAV载体在人类基因治疗中的应用.
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西罗莫司高产菌株与野生菌株中FKBP25的初步比较
目的对比西罗莫司高产突变菌株--吸水链霉菌R27、R388、R441和野生菌株--吸水链霉菌ATCC 367817的蛋白质电泳图谱及FKBP25含量的差异,探讨FKBP25与西罗莫司产量的可能关系.方法制备、分离高产突变株与野生菌株的菌体蛋白质并进行PPIase活性测定,比较3株西罗莫司高产突变株与野生菌株的蛋白质电泳图谱及PPIase酶活性.结果西罗莫司低产的野生菌株的FKBP25含量比西罗莫司高产突变菌株高.结论初步认为在吸水链霉菌中西罗莫司的产量与 FKBP25量的多寡呈现一定的相关性.
关键词： 西罗莫司 FK506结合蛋白 肽酰-脯氨酰顺-反异构酶 吸水链霉菌 -
杜氏盐藻FKBP cDNA的克隆及其在鞭毛解组装中的功能
目的:克隆杜氏盐藻FK506结合蛋白(FKBP)的cDNA片段并探讨其与鞭毛微管解组装的联系.方法:提取杜氏盐藻总RNA,根据已知盐藻FKBP cDNA 3'端序列,用5'RACE方法扩增该cDNA的5'端序列,拼接得到全长并对其序列进行分析.秋水仙碱处理对数生长期杜氏盐藻,处理0、20、40、60、80、100、120、140和160 min后采用实时荧光定量PCR检测FKBP mRNA的表达情况.结果:经5'RACE得到681 bp的FKBP cDNA片段,拼接后得到的cDNA全长1 075 bp,序列分析显示其开放阅读框为762 bp,编码253个氨基酸；经BLAST比对,其氨基酸序列具有FKBP家族特有的功能结构域,与莱茵衣藻、团藻、小球藻、大麦及水稻的同源性分别为61％、54％、47％、48％和51％.杜氏盐藻细胞FKBP mRNA表达量在秋水仙碱处理后20～40 min明显升高,而在40 ～ 100 min时逐渐下降,但仍高于对照组(F组间=32.580,P＜0.001；F时间=5.543,P=0.001；F交互=237.306,P＜0.001).结论:得到了杜氏盐藻的FKBPcDNA全长序列；FKBP参与了杜氏盐藻微管解组装过程,可能参与了细胞通过鞭毛对外界应激反应的应答.
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慢性心衰大鼠心肌细胞内雷尼丁受体及其调节蛋白Calstabin2表达异常的研究
目的 研究慢性心衰大鼠心肌细胞肌浆网雷尼丁受体及其调节蛋白FK506结合蛋白(Calstabin2)的异常表达.方法 雄性SD大鼠25只,按照3:2的比例随机分为心衰组(15只)和假手术组(10只),运用激光扫描共聚焦显微镜、Western-blot等方法研究2组大鼠心肌细胞肌浆网内钙容量及钙释放通道雷尼丁受体(RyR2)和其调节蛋白Calstabin2表达的变化.结果 慢性心衰大鼠心功能LVEDP(8.91±2.16) mmHg、dp/dtmax(2 250.19±172.44) mmHg/s,显著低于假手术组大鼠心功能LVEDP(4.17±1.15) mmHg、dp/dtmax (4 822.54±221.62) mmHg/s(P＜0.05);慢性心衰大鼠心肌细胞肌浆网内钙容量△F/F0=25.3±2.8,显著低于假手术组大鼠肌浆网内钙容量△F/F0=47.8±3.5(P＜0.05);慢性心衰大鼠心肌细胞内Calstabin2的表达较对照组下调.结论 Calstabin2的表达下调所致RyR2稳定性下降是导致心衰的原因之一.
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慢性心衰大鼠心肌细胞内异常的钙通道研究
目的 研究慢性心衰大鼠心肌细胞内异常的钙通道.方法 将雄性SD大鼠被随机分为手术组和假手术组,运用激光扫描共聚焦显微镜、Western-blot等方法研究胞浆内咖啡因诱导钙瞬变及钙释放通道RyR2和其调节蛋白FKBP12.6表达的变化.结果 慢性心衰大鼠心肌细胞内钙瞬变(△F/F0=11.9 ±0.9)显著低于对照组大鼠心肌细胞内钙瞬变(AF/F0 =33.2±1.6,P＜0.05);慢性心衰大鼠心肌细胞内FKBP12.6的表达较对照组下调.结论 FKBP12.6表达下调所致Ca2+泄漏是导致心衰的原因之一.
