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响应面法优化金霉素发酵培养基
目的 采用响应面法对金色链霉菌发酵产金霉素培养基进行优化.方法 首先采用Plackett-Burman实验筛选出影响金色链霉菌发酵产生金霉素的主要影响因素,然后通过速上升实验逼近大值响应区域,后采用Box-Behnken设计响应面方法确定主要影响因素的浓度,得到金霉素优化发酵培养基组成.结果 玉米淀粉、酵母粉、(NH4)2SO4为对金霉素产量有显著影响的主要因素,佳水平为:玉米淀粉125.10 g·L-1、酵母粉4.03 g·L-1、(NH4)2SO4 4.87 g·L-1.在优化发酵培养基条件下,金霉素发酵单位为22.813 g·L-1,与预测值接近,较优化前发酵单位19.476 g·L-1提高了17％.结论 响应面实验设计和分析方法能够有效地对金霉素发酵培养基进行优化.
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常压室温等离子体诱变高产去甲金霉素金色链霉菌
采用新型常压室温等离子体(ARTP)诱变技术,基于96孔板高通量筛选及高效液相色谱检测,获得一株金色链霉菌突变株A6-6-9,其去甲金霉素(1)产量较出发菌提高22.5％.经4次传代,突变株A6-6-9的遗传稳定性良好.与出发菌相比,在相同的摇瓶发酵过程中,突变株氨基氮利用率加快,生长和糖消耗速率减慢,产1能力提高.有机酸的变化趋势表明,突变株比出发菌积累更多的草酰乙酸、丙二酸等前体有机酸,流向丙二酰辅酶A的合成,进而提高1产量.二维电泳及质谱结果显示,苹果酸脱氢酶、谷氨酰胺合成酶、6-羟基化酶等与1合成密切相关的酶在突变株中表达更多,推测也是突变株高产1的一个重要原因.
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金霉素发酵条件优化
在50L发酵罐中金霉素发酵适宜的接种量为14.0%、种龄为20～21h(种子效价为200μg/ml左右).3种不同的酵母粉中,2号酵母粉对金霉素发酵的效果好,效价比其余两种高5.3%和4.4%.加入0.3%的酵母膏对金霉素发酵后期有一定的促进作用,效价比对照高4.4%.在120m3发酵罐中,利用数据驱动型方法对发酵过程进行优化,金霉素效价达到21912μg/ml,比对照高出13%.
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打靶载体PIJ792的构建
目的 利用pIJ790,pIJ773和pUC19等基本质粒,构建金色链霉茵基因打靶筛选体系所需质粒pIJ792.方法 以质粒pIJ790为模板,将PCR扩增的cat基因片段插入到pMD19-T的多克隆位点,得重组质粒pFD31.EcoR Ⅰ和Hind Ⅲ双酶切pIJ773,其小片段与pUC19经同样双酶切后的片段酶连克隆,得新质粒pFD32.pFD31和pFD32再分剐经Sac Ⅰ酶切,将pFD31含Cat的小片段和pFD32的大片段酶连克隆,筛选得重组质粒pFD33,EcoR Ⅰ与Hind Ⅲ酶切,将切下的两个小片段与pIJ773经同样双酶切后的大片段进行酶连克隆,终得筛选质粒pIJ792.结果 新质拉pIJ792的抗氯霉素能力超过150λg·mL-1.结论 pIJ792可满足金色链霉菌基因打靶的筛选需要,实现了用于金色链霉菌PCR基因打靶所需筛选体系的构建.
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四环素生产菌诱变育种与发酵性能的研究
采用紫外线对四环素生产菌金色链霉菌4-28的原生质体进行诱变处理,选育得到一株高产突变株H32-37.该菌在形态上与出发菌株存在明显差异:菌落小,呈圆形或梅花形,表面粗糙,孢子丰富,孢子颜色深,四环素生产能力比出发菌株提高23.9%.研究了其发酵性能,优化了培养基组成和发酵工艺条件,使四环素效价提高了44.4%.
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采用氯化锂和紫外线复合诱变方法筛选四环素高产菌株
目的筛选优良高产四环素生产菌株,以提高生产发酵水平.方法采用氯化锂和紫外线复合诱变单孢子悬浮液.结果经过初筛、复筛,获得活性提高12.3%～37%的变株.结论氯化锂与紫外线复合诱变四环素产生菌可以获得高产菌株,同时氯化锂的使用对于菌株发酵的终成品质量无任何不良影响.
