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自噬相关基因LC3B真核表达载体构建及胃癌细胞自噬的观察
目的:构建人自噬相关基因微管相关蛋白1轻链3B(microtubule associated protein 1 light chain 3B,LC3B)真核表达载体,并鉴定其生物学功能.方法:通过RT-PCR方法扩增得到人LC3B cDNA,应用基因重组技术构建pEGFP-C1-LC3B真核表达载体,通过酶切和测序进行鉴定.将pEGFP-N1-LC3B表达载体转染胃癌细胞MKN1,倒置荧光显微镜观察饥饿诱导后细胞中EGFP-LC3B的表达及分布变化.结果:通过测序鉴定,pEGFP-N1-LC3B真核表达载体序列正确,编码框正确.转染后的MKN1细胞经饥饿诱导后,检测发现EGFP-LC3B由散在分布向点状分布改变,即生成细胞自噬体.结论:成功构建了人自噬相关基因LC3B真核表达载体,并证实饥饿诱导胃癌细胞自噬的发生,为进一步研究自噬在肿瘤中的作用机制奠定了基础.
关键词： 微管相关蛋白1轻链3B 自噬 基因表达 MKN1细胞 转染 -
人自噬相关基因LC3B真核表达载体的构建及鉴定
目的:构建人自噬相关基因微管相关蛋白1轻链3B (microtubule-associated protein 1 light chain 3B,MAP1LC3B)真核表达栽体,并鉴定其生物学功能.方法:通过RT-PCR方法扩增得到人MAP1LC3B cDNA;应用基因重组技术构建pEGFP-N1-LC3B真核表达载体,通过酶切和测序进行鉴定;倒置荧光显微镜下观察EBBS诱导4 h后pEGFP-N1-LC3B表达载体转染的HepG2.2.15细胞质中GFP-LC3B分布的变化.结果:通过测序鉴定,pEGFP-N1-LC3B真核表达载体序列正确,编码框正确;转染后的HepG2.2.15细胞经EBBS诱导4 h后,倒置荧光显微镜检测发现GFP-LC3B由散在分布向点状分布改变.结论:成功构建了人自噬相关基因LC3B真核表达载体,为进一步研究自噬在乙型肝炎病毒中的作用机制奠定了基础.
关键词： 基因表达 微管相关蛋白1轻链3B HepG2.2.15细胞 自噬 -
沉默多嘧啶束结合蛋白相关剪切因子诱导结肠癌细胞增殖抑制和凋亡的作用及机制
目的 探讨沉默多嘧啶束结合蛋白相关剪切因子(PSF)后对结肠癌细胞增殖和凋亡的影响及其机制.方法 对人结肠癌DLD-1细胞构建针对PSF的小干扰RNA (siRNA-PSF),转染48 h后,观察PSF基因沉默前后对结肠癌细胞增殖、凋亡的影响,同时应用实时荧光定量聚合酶链反应(FQ-PCR)和Western blot检测PSF基因沉默前后结肠癌细胞中自噬蛋白微管相关蛋白1轻链3B(LC3B)的表达变化.结果 与未转染组和转染siRNA-vector组比较,转染siRNA-PSF后,结肠癌DLD-1细胞PSF表达明显下降(P＜0.05),同时其增殖明显抑制,DNA增殖荧光值为25.05±3.94比132.88±8.73、127.61±8.02(P ＜0.05),而凋亡明显增加,凋亡率为(54.6±5.5)％比(8.5±1.3)％、(10.1±2.0)％(P＜0.05).FQ-PCR和Western blot检测显示沉默PSF后,结肠癌DLD-1细胞的LC3B表达也明显减少(P＜0.05).结论 沉默PSF后通过抑制自噬蛋白LC3B表达诱导结肠癌细胞增殖抑制和凋亡.
关键词： 结肠癌 多嘧啶束结合蛋白相关剪切凶子 增殖 脱噬作用 微管相关蛋白1轻链3B
