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HMGB1基因真核细胞表达载体的构建及其在人脐静脉血管内皮细胞中的表达
目的 构建HMGB1基因真核细胞表达载体并检测其在真核细胞中的表达.方法 提取人脐静脉血管内皮细胞(HUVEC)总RNA,反转录为cDNA.PCR扩增HMGB1全长编码基因,构建成pcDNA-3.1-myc-his-B-HMGB1真核细胞表达载体.转染HUVEC,Western blot检测转染后HMGB1基因的表达改变.结果 构建HMGB1全长基因真核细胞表达载体成功,酶切鉴定及测序鉴定表明载体构建正确,转染HUVEC后可检测到外源性蛋白的表达,对照组无外源性蛋白表达.结论 成功构建了HMGB1全长基因真核细胞表达载体并可转染至HUVEC中.
关键词： 高迁移率族蛋白1基因 人脐静脉血管内皮细胞 真核细胞表达载体 转染 -
HMGB1基因沉默促进多柔比星诱导的胃癌BGC-823细胞自噬及凋亡
目的:探讨高迁移率族蛋白1(high-mobility group box 1,HMGB1)基因沉默对化疗药物多柔比星(doxorubicin,DOX)诱导BGC-823胃癌细胞发生自噬和凋亡的影响.方法:MTT、Western blotting和激光共聚焦显微镜分别检测DOX对BGC-823细胞增殖及微管相关蛋白轻链3-Ⅰ(microtubule light chain-3 Ⅰ,LC3 Ⅰ)、LC3Ⅱ表达和自噬小体形成的影响.构建靶向HMGB1的shRNA载体pSuper-shHMGBl及其对照载体pSuper-shNC并转染BGC-823胃癌细胞,建立HMGB1稳定沉默的细胞系.DOX处理不同质粒转染组的BGC-823胃癌细胞,激光共聚焦显微镜观察HMGB1沉默对DOX诱导的自噬小体形成的影响,MTT法、流式细胞术分别检测对细胞增殖和凋亡的影响,Western blotting检测对自噬及凋亡相关蛋白(HMGB1、LC3、Bcl-2、Bcl-XL、Mcl-1和激活型caspase-3)表达的影响.结果:DOX可上调BGC-823细胞中LC3-Ⅱ蛋白的水平和促进细胞自噬体的形成(P＜0.01).与对照组相比,HMGB1基因沉默可减少DOX诱导的胃癌细胞自噬[(19.33 ±2.96)％ vs (71.67±3.38)％,P＜0.01],促进胃癌细胞发生凋亡[(46.12±3.15)％vs (12.37±2.84)％,P＜0.05],上调激活型caspase-3的表达水平.进一步分析发现,DOX诱导胃癌细胞发生自噬时,Mcl-1的降解增加,而Bcl-2和Bcl-XL表达无明显变化;HMGB1基因沉默可抑制DOX诱导的Mcl-1降解.结论:DOX可诱导BGC-823胃癌细胞发生自噬,HMGB1基因沉默有助于逆转胃癌细胞对DOX的耐药性,促进胃癌细胞发生凋亡.
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HMGB1基因SNP位点实时荧光PCR检测方法的建立
目的 建立基于TaqMan探针实时荧光PCR技术的高迁移率族蛋白1(high mobility group box-1 protein,HMGB1)基因单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism,SNP)检测方法.方法 收集2014年4月在深圳口岸医院体检的健康人群样本20份,选择HMGB1基因上的2个SNP位点设计常规PCR和实时荧光PCR扩增引物和TaqMan探针,采用基因测序和实时荧光PCR方法对样本进行SNP分型.结果 实时荧光PCR方法SNP分型结果显示,在20份样本中的HMGB1基因rs1412125位点检测到TT基因型11例,CC基因型1例,TC基因型8例;HMGB1基因rs3742305位点检测到GG基因型15例,GC基因型5例,未发现CC基因型.这一结果与基因测序方法结论完全一致.结论 基于TaqMan探针技术的实时荧光PCR方法进行HMGB1基因SNP分型简单、快速、高效,可用于人群大规模样本的SNP筛查,具有广泛应用的价值.
关键词： TaqMan探针 实时荧光PCR 单核苷酸多态性 高迁移率族蛋白1基因
