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C/EBPα不同截短功能域GST融合蛋白表达载体的构建及表达的研究
目的 构建GST-C/EBPa融合蛋白表达载体,并在大肠埃希茵(E.coli)中诱导表达.方法 以质粒pcDNA3.1-C/EBPa为模板,用PCR法扩增C/EBPα全长及各个截短片段,通过EcoRI和XhoI酶切位点将C/EBPα全长及各个截短突变体定向插入pGEX-5X-1中,构建原核表达质粒pGEX-5X-1-C/EBPα及其截短突变体,并转化E-coliDH5α筛选阳性重组子,限制性内切酶酶切鉴定和DNA序列测定正确后,转入E.coli BL21中,异丙基硫代β-D半乳糖苷诱导表达,SDS-PAGE和SDS-PAGE鉴定.结果 酶切及测序结果证明,成功构建了原核表达质粒pGEX-5X-1-C/EBPα及其截短突变体,并用SDS-PAGE方法证实了GST-C/EBPa全长及各个截短突变体融合蛋白的表达.结论 成功构建了C/EBPa原核表达载体及其截短突变体,并证实了融合蛋白的表达,为进一步纯化C/EBPa蛋白和研究C/EBPa的生物学功能奠定了基础.
关键词： CCAAT增强子结合蛋白α 截短突变体 质粒 原核表达 -
GST/HIF-1α(融合蛋白表达载体的构建及其在大肠埃希菌中的表达
目的 构建GST/HIF-1α融合蛋白表达载体,并在大肠埃希菌(E.coli)中诱导表达.方法 以质粒pcDNA3.1-HIF-1α为模板,用PCR法扩增HIF-1α全长及各个截短片段,通过BamHI和Not I酶切位点将HIF-1α全长及各个截短突变体定向插入pGEx-4T-2中,构建原核表达质粒pGEX-4T-2-HIF-1α及其截短突变体,并转化E.coli DH5α,筛选阳性重组子,限制性内切酶酶切鉴定和DNA序列测定正确后,转入E.coli BL21中,异丙基硫代β-D半乳糖苷诱导表达,SDS-PAGE和Western blot鉴定.结果 酶切及测序结果证明,成功构建了原核表达质粒pGEX-4T-2-HIF-1α及其截短突变体,并用Western blot方法证实了GST/HIF-1α全长及各个截短突变体融合蛋白的表达.结论 成功构建了HIF-1α原核表达载体及其截短突变体,并证实了融合蛋白的表达,为进一步纯化HIF-1α蛋白和研究HIF-1α的生物学功能奠定了基础.
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GST-LMO1融合蛋白表达载体的构建及其在原核细胞中的表达
目的 构建GST-LMO1融合蛋白表达载体,并在原核细胞大肠埃希菌(E.coli)中诱导表达.方法 以人胎脑文库为模板,用PCR方法法扩增出LMO1基因全长及各个截短突变体,通过BamH Ⅰ和EcoR Ⅰ酶切位点分别将其定向插入pGEX-5X-2载体中,构建原核表达质粒pGEX-5X-2-LMO1及其截短突变体,通过酶切电泳鉴定和DNA序列测定正确后,转入E.coli BL21中,经异丙基硫代β-D半乳糖苷诱导表达,SDS-PAGE和Western blot鉴定.结果 酶切电泳及测序结果证明,成功构建了原核表达质粒pGEX-5X-2-LMO1及其截短突变体,并用Western blot方法证实了GST-LMO1全长及各个截短突变体融合蛋白的表达.结论 成功构建了LMO1全长及其截短突变体原核表达载体,并证实了其在原核细胞大肠埃希菌中的表达,为LMO1结构与功能的研究提供了前提基础.
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NDRG2截短体真核表达载体的构建
目的：构建稳定表达N-MYC下游调节基因2（NDRG2）截短体的真核表达载体。方法分别用PCR方法扩增NDRG2的截短体NDRG21～178aa和NDRG21～257aa ，以BamHⅠ和EcoRⅠ酶切后，以SolutionⅠ连接酶反应体系将NDRG2截短体片段装载入pCDNA4．0表达载体中，并通过蛋白免疫印迹（Western blotting）验证载体的表达。结果 NDRG2截短体在pCDNA4．0表达载体中正确表达。结论成功构建了NDRG2截短体的真核表达载体。
关键词： N-myc下游调节基因2 截短突变体 pCNDA4.0载体 -
YggG截短蛋白的表达及其抗体的制备
目的:在大肠杆菌中表达截短的YggG蛋白,并制备兔抗YggG截短体抗体.方法:从含有大肠杆菌yggg基因全长DNA的质粒中,用PCR扩增截短的yggg基因序列,克隆人非融合表达载体pDH2中,构建YggG截短体的高表达工程菌,并温敏诱导表达非毒性的YggG蛋白,薄层扫描检测目的蛋白含量.免疫家兔制备兔抗YggG突变体抗血清,并以Western-blot检测抗体效价、鉴定抗体特异性.结果:大肠杆菌中表达的YggG截短突变体蛋白占菌体总蛋白的31.7%.抗血清效价约1:2 000,Western blot分析显示抗血清具有较高的特异性.结论:成功地获得了YggG截短体蛋白,并制备了兔抗YggG突变体抗血清.用制备的该抗血清可检测到野生型全长YggG蛋白的表达.
