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卡铂短期诱导人卵巢癌类干细胞的分离及初步鉴定
目的 分离卡铂耐药型人卵巢癌类干细胞,为研发和筛选针对卡铂耐药的卵巢癌二线治疗药物提供细胞模型.方法 从卵巢癌组织或腹水中分离培养卵巢癌细胞,直接或采用卡铂短期诱导后无血清悬浮培养,分离纯化获得卵巢癌类干细胞球,采用免疫荧光法或流式细胞术检测干细胞标志物的表达.结果 卵巢癌原代细胞直接或采用卡铂短期诱导后无血清悬浮培养能够形成类干细胞球,并高表达干细胞标记物CD133,ALDH1,ABCG2和CD24.卡铂短期诱导分离的卵巢癌干细胞球中CD24+细胞含量明显增加.结论 原代培养卵巢癌细胞经卡铂短期诱导后无血清悬浮培养,能进一步富集纯化卵巢癌类干细胞,可作为卵巢癌耐药研究的理想细胞模型.
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重组抗狂犬病病毒抗体在HEK293EBNA1细胞中的瞬时表达优化
目的:优化重组抗体在悬浮无血清培养的HEK293 EBNA1瞬时表达,提高重组抗体表达量.方法:将HEK293 EBNA1细胞适应于无血清悬浮培养,筛选适宜的无血清培养基.使用PEI转染质粒进入细胞,瞬时表达重组抗体;使用Modde软件进行实验设计(DOE),优化转染质粒量、轻重链比例、PEI量等影响瞬时表达的条件.培养上清经亲和纯化,获得目标抗体,用快速免疫荧光灶抑制试验(RFFIT)测定抗体活性,用BCA法测定纯化抗体浓度.结果:293 SFMII为适宜的HEK293 EBNA1细胞无血清悬浮培养基.对抗体表达影响大的因素是轻重链比例(P=0.00000),其次为质粒浓度(P=0.00086),后为PEI(P=0.00257).优化的转染条件为:质粒用量0.61 μg/106细胞,轻重链比例2:1,PEI 2.67 μg/106细胞,优化后抗体表达量有显著提高(P=0.007).结论:通过DOE优化获得了重组抗狂犬病病毒抗体的高水平表达,抗体表达量提高了至少50倍.
关键词： HEK293 EBNA1 无血清悬浮培养 抗体瞬时表达 实验设计 -
不同无血清培养方式提取SHG44人脑胶质瘤干细胞的比较研究
目的 筛选较理想的SHG44人脑胶质瘤干细胞的培养方法.方法 采用无血清培养基(含EGF、FGF、B27)以培养皿、培养瓶及悬浮细胞培养板为载体培养SHG44人脑胶质瘤干细胞,通过CD133、Nestin联合Bcl-2标记进行免疫荧光鉴定,并对比其倒置显微镜下细胞形态及干细胞球的形态、大小及数目.结果 培养皿和培养瓶初次富集的SHG44胶质瘤干细胞球呈较大不规则形,经二、三次纯化后发现第二与三次纯化后的大部分胶质瘤干细胞呈不规则分化状,大部分胶质瘤干细胞球呈分散、较小、不规则形生长,但第三次比第一、二次有更少的胶质瘤干细胞球却呈更规则球形生长;悬浮细胞培养板提取、纯化的干细胞呈类圆形,基本全部形成胶质瘤干细胞球,且第三次比第一、二次纯化的干细胞球呈更大更规则球形生长;经统计分析悬浮培养板培养纯化的胶质瘤干细胞球较培养皿和培养瓶纯化的胶质瘤干细胞球大且数目多(P＜0.05);对于悬浮培养板,随着纯化次数增加,胶质瘤干细胞球更大、数目更多(P＜0.05),且呈更规则球形.结论 无血清培养基以悬浮细胞培养板为载体纯化胶质瘤干细胞是较理想的方法.
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无血清悬浮培养法富集结肠癌干细胞
目的 初步富集结肠癌干细胞球,并对其进行鉴定.方法 无血清悬浮培养初步富集结肠癌干细胞,流式细胞术,细胞分化实验,NOD/SCID小鼠致瘤实验鉴定其生物学特性.结果 结肠癌细胞株CW-2细胞能在SFM中存活、增殖并形成肿瘤干细胞球；分离后细胞中CD44+EPCAM+癌于细胞含量为60.39％；肿瘤干细胞球的增殖能力、致瘤能力均强于含血清培养细胞(P＜0.05).结论 无血清悬浮培养可以初步富集结肠癌干细胞.
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免疫磁珠及无血清悬浮培养法对肝癌干细胞的分离与富集
目的 评估免疫磁珠分选技术分选肝癌干细胞的效率.方法 ①CD90的表达检测:采用免疫组织化学染色SP法检测8例正常肝组织、58例肝癌及其癌旁组织中CD90的表达.②细胞系筛选:将Huh-7、MHCC97-H、SMMC-7721及Be17402细胞系分为空白对照组和实验组(细胞数量均为5.5×105个,均为1孔),实验组细胞中加入5μLCD90-PE抗体,空白对照组加入5μL CD90-无荧光抗体.采用流式细胞术检测4种细胞系空白对照组和实验组的CD90+细胞比例,以筛选细胞.③免疫磁珠分选:将Huh-7和MHCC97-H细胞系分别进行磁珠标记后进行磁珠分选.收集流经磁珠分选柱(MS)后的细胞悬液1 mL,作为CD90-组;将MS移出磁场区域,加入1 mL PBS缓冲液快速冲洗至离心管中,标记为CD90+组;以未分选细胞作为空白对照组(加入CD90-无荧光抗体)和未分选实验组(加入CD90-PE抗体).对Huh-7细胞系进行二次分选.采用流式细胞仪检测4组细胞中的CD90+细胞比例.④无血清培养和含血清培养:将Huh-7细胞接种到无血清培养基专用6孔板中进行培养(无血清和含血清悬浮培养均为l孔),1周后采用流式细胞仪检测无血清培养和含血清培养后细胞中的CD90+细胞比例.结果 ①正常肝组织中CD90的表达阳性率为0(0/8),肝癌组织为65.5％ (38/58),癌旁组织为20.7％(12/58).肝癌组织中CD90的表达阳性率较正常肝组织(x2=6.78,P＜0.05)和癌旁组织高(x2=20.83,P＜0.05).②Huh-7、MHCC97-H、SMMC-7721及Be17402细胞系中实验组的CD90+细胞比例分别为0.851％、1.090％、2.710％及4.050％,空白对照组分别为0.241％、0.688％、1.890％及2.080％,故选择Huh-7和MHCC97-H细胞系进行下一步的免疫磁珠分选.③Huh-7细胞经一次分选后:未分选空白对照组的CD90+细胞比例为0.241％,未分选实验组为0.851％,CD90-组为0.574％,CD90+组为1.100％;二次分选后:未分选空白对照组的CD90+细胞比例为0.032％,未分选实验组为0.961％,CD90-组为0.426％,CD90+组为9.700％.结论 正常肝组织实质细胞不表达CD90,肝癌组织高表达CD90.肝癌细胞系Huh-7和MHCC97-H中存在少量的CD90+细胞,免疫磁珠分选法能明显提高CD90+细胞比例,但作用十分有限.无血清悬浮培养法对富集CD90+细胞无明显作用.
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人大细胞肺癌干细胞样细胞的富集及其功能研究
背景与目的 目前国内外还没有确切的、得到公认的肺癌干细胞的筛选标记分子、指标和方法,常用方法 为通过流式细胞技术,借鉴其他肿瘤干细胞分选标记来分选肺癌干细胞,但其筛选特异性低、工作量巨大.本研究采用无血清悬浮培养法富集肺癌干细胞,对肺癌干细胞的筛选方法 进行探索.方法 采用添加生长因子的无血清培养基对人大细胞肺癌细胞株L9981进行悬浮培养,获得肺癌细胞球体.对含血清培养贴壁L9981细胞和无血清培养成球后的L9981细胞,通过显微镜下观察比较二者的生物学形态,应用Vi-cell细胞活力分析仪计数细胞并绘制生长曲线比较二者的增殖能力,通过Transwell实验研究它们的侵袭能力差异,并通过接种裸鼠观察二者在体内的成瘤性来研究肺癌细胞球体的生物学功能.结果 与血清贴壁培养L9981细胞相比,无血清培养L9981细胞成球形生长,贴壁L9981和L9981球体细胞的倍增时间分别为(56.05±1.95)h和(33.00±1.44)h,球体细胞的侵袭和成瘤能力分别为贴壁L9981细胞的5倍和20倍.结论 通过无血清悬浮培养的L9981细胞可以形成肺癌球体细胞群,L9981球体细胞的侵袭和成瘤能力均明显高于贴壁L9981细胞,显示L9981球体细胞中富集了肺癌干细胞样的细胞.无血清悬浮培养肺癌球体细胞可作为富集肺癌干细胞样细胞的一种候选方法.
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组蛋白去甲基化酶JMJD3对乳腺癌干细胞的影响
目的 探索组蛋白去甲基化酶JMJD3对乳腺癌于细胞(BCSCs)的影响.方法 采用改良后的无血清悬浮培养肿瘤干细胞的方法从乳腺癌MCF-7细胞系中分离扩增BCSCs;通过流式侧群细胞分选和免疫缺陷裸鼠腋下接种的方法检测BCSCs的生物学特性和致瘤性.采用Western Blot研究MCF-7及BCSCs中JMJD3表达的差异;采用CCK-8法检测JMJD3促进剂U0126及抑制剂GSK-J1对MCF-7增殖的影响;通过流式细胞侧群分选,检测GSK-J1、U0126对MCF-7中BCSCs比例的影响;采用Western Blot法研究GSK-J1、U0126对BCSCs中JMJD3蛋白表达的影响.结果 改良后的无血清悬浮培养方法可成功地从MCF-7细胞系中分离并富集BCSCs;与MCF-7比较,BCSCs呈现出高致瘤性、JMJD3蛋白低表达性;U0126可抑制MCF-7的增殖,并降低MCF-7中BCSCs的比例,促进BCSCs中JMJD3的表达,而GSK-J1则呈现出相反的作用.结论 JMJD3可抑制乳腺癌细胞的增殖,这种抑制作用可能与减少MCF-7中干细胞的比例有关.
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酚红对无血清悬浮培养条件下肿瘤干细胞微球形成的影响
目的 研究酚红对无血清悬浮培养条件下肿瘤干细胞微球形成的影响.方法 将人胶质瘤细胞U251、人乳腺癌细胞MCF-7、人肝癌细胞SMMC-7721、人宫颈癌细胞Hela等细胞分为酚红组和无酚红组,分别悬浮培养于添加了生长因子的DMEM-F12培养基中,观察5d后肿瘤干细胞微球的形成情况,并计算微球的形成率.结果 U215无酚红组细胞的微球形成率为3.38％,明显高于酚红组的(2.73％);MCF-7、SMMC-7721、Hela无酚红组细胞的微球形成率分别为6.81％、7.75％、7.18％,酚红组的细胞均无微球形成.结论 无血清悬浮培养肿瘤干细胞应采用无酚红培养基.
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SHG44人脑胶质瘤干细胞的提取、纯化与鉴定
目的:探讨SHG44人脑胶质瘤干细胞的提取、纯化与鉴定方法.方法:采用以6孔悬浮细胞培养板为载体的无血清DMEM/F12培养基(含EGF、FGF、B27)提取与纯化SHG44人脑胶质瘤干细胞,通过CD133联合Nestin标记进行免疫荧光鉴定,并在倒置显微镜下观察细胞形态及干细胞球的形态、大小及数目.结果:SHG44人脑胶质瘤干细胞能在含无血清DMEM/F12培养基的6孔悬浮细胞培养板中存活、增殖并形成干细胞球;悬浮培养3d初步形成呈巢状悬浮生长的胶质瘤干细胞团,7d后干细胞球大小、形态基本不变.经统计分析,悬浮培养板培养纯化的胶质瘤干细胞球,随着纯化次数增加,胶质瘤干细胞球更大、数目更多(P＜0.05),且呈更规则球形.结论:本研究成功提取、纯化、鉴定出SHG44胶质瘤干细胞,并进行传代扩增培养;Cyagen悬浮细胞培养板可作为筛选胶质瘤干细胞的理想载体.
关键词： SHG44胶质瘤干细胞 无血清悬浮培养 悬浮细胞培养板 CD133 巢蛋白
