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pull-down实验文献资料
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CaM突变体质粒的构建、表达纯化及活性鉴定
目的 制备钙调蛋白(CaM)突变体CaME141G的融合蛋白质粒,并进行蛋白表达、提取纯化和活性鉴定.方法 利用定点突变技术将野生型CaM的第141个氨基酸E(GAG)突变为G(GGG),再将突变体质粒转化大肠杆菌BL21感受态细胞,大量培养后诱导其GST融合蛋白表达,GS-4B beads纯化,PreScission protease酶切GST标签,采用Bradford方法测定纯化后蛋白浓度,SDS-PAGE凝胶电泳检测CaME141G蛋白的相对分子量和纯度,pull-down实验鉴定纯化后蛋白的生物活性.结果 提取纯化后的CaME141G蛋白具有较高的浓度和纯度,且能与心肌CaV1. 2钙通道C末端的PreIQ蛋白片段结合,并具有CaME141G蛋白浓度依赖性,提示该蛋白具有与心肌CaV1. 2钙通道结合的能力.结论 成功构建了CaME141G融合蛋白质粒,并获得了纯化后的CaME141G蛋白,为深入研究CaM突变体在心肌CaV1. 2钙通道中的调节作用及其与心血管系统疾病的关系奠定了基础.
关键词： 钙调蛋白 突变体 质粒 表达纯化 pull-down实验
