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ALEX1基因过表达慢病毒载体的构建和鉴定
目的:探讨构建Arm重复蛋白1(ALEX1)基因过表达慢病毒表达载体,感染乳腺癌细胞系SK-BR3后观察ALEXI的表达,为研究ALEX1在乳腺癌中的作用及机制奠定基础.方法:利用DNA重组技术将ALEX1基因插入到慢病毒穿梭质粒LV5中,获得重组慢病毒质粒V-ALEX1,经酶切鉴定及DNA测序鉴定后,用Lipofectamine 2000将重组质粒和慢病毒包装质粒系统(pGag/Pol、pRev、pVSV-G)转染293T细胞中包装成重组慢病毒颗粒,经流式细胞术测定重组慢病毒滴度.将成功包装的ALEX1过表达慢病毒载体(LV5-ALEX1)和阴性对照载体(LV5-NC),感染SK-BR3细胞(MOI为10)48～72 h,Realtime PCR和Western blot法分析ALEX1表达情况.结果:酶切鉴定结果显示:产生约1 500 bp的片段,片段大小与ALEX1基因cDNA大小一致.DNA测序比对说明测序结果与预期ALEX1基因序列完全一致,证实ALEX1基因正确插入载体中,成功构建ALEX1基因过表达载体.经293T细胞包装后,成功获得病毒滴度为4.25x108 TU/ml的重组慢病毒LV5-ALEX1.Realtime PCR和western blot结果显示:与感染LV5-NC的SK-BR3细胞相比,LV5-ALEX1感染可明显增加ALEX1 mRNA及蛋白的表达水平.结论:成功构建ALEX1基因过表达慢病毒载体,ALEX1基因过表达慢病毒能够感染乳腺癌SK-BR3细胞,可使外源基因获得稳定过表达.
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ALEX1在宫颈癌中的表达及对宫颈癌细胞生物学行为的影响
目的：研究ALEX1基因在宫颈癌组织与癌旁组织中的表达情况,探讨ALEX1基因对宫颈癌细胞生物学行为的影响。方法应用免疫组化检测临床宫颈癌组织与癌旁组织中 ALEX1的表达情况,通过小干扰 RNA 技术沉默ALEX1,并通过流式细胞仪检测沉默ALEX1后HeLa细胞的周期、凋亡变化情况,利用CCK-8检测其增殖情况及对抗癌药物白藜芦醇敏感性的影响。结果免疫组化结果显示,临床宫颈癌组织中ALEX1高表达。与对照组HeLa细胞相比,沉默ALEX1实验组细胞生长受到明显抑制,并且增强白藜芦醇对其的抑制作用,细胞周期阻滞在 S期。结论沉默ALEX1能有效阻滞HeLa细胞的生长能力及增强白藜芦醇对HeLa细胞的抑制作用。
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ALEX1在乳腺癌中的表达及其临床意义
目的：检测乳腺癌组织中ALEX1的表达水平，明确ALEX1与其临床病理特征是否具有相关性。方法：应用real-time PCR、免疫组化方法检测乳腺癌组织中ALEX1含量。结果：乳腺癌组织ALEX1蛋白的表达水平低于癌旁组织（P＜0.01）；ALEX1的表达与乳腺癌病理分级、临床分期和分子分型有关（P＜0.05），而与病人年龄、肿瘤大小和肿瘤类型无关。此外，real-time PCR结果表明，乳腺癌组织中ALEX1的mRNA表达明显低于对应的癌旁组织（P＜0.01）。结论：ALEX1在乳腺癌组织中的表达明显低于相应的癌旁组织，乳腺癌的病理分级、临床分期越高，ALEX1的表达水平越低。
