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含pIRES2-EGFP-4-1BBL质粒减毒沙门氏菌株的构建与鉴定
目的:构建含pIRES2-EGFP-4-1BBL质粒的SL3261(减毒鼠伤寒沙门氏菌)疫苗菌.方法:将质粒pIRES2-EGFP-4-1BBL转入LB5000(鼠伤寒沙门氏菌)进行甲基化,利用修饰后重组质粒转化终宿主菌SL3261,抗生素筛选后挑取单个菌落扩增进行抽提质粒和PCR鉴定,SL3261疫苗菌与HepG2细胞体外共培养,荧光显微镜和RT-PCR分别检测GFP(绿荧光蛋白)的表达和4-1BBL基因的转录.结果:导入pIRES2-EGFP-4-1BBL质粒的SL3261经抽提质粒电泳后获得了同原转化质粒相同大小的目的条带,质粒PCR获得了约930 bp的条带,200个HepG2细胞感染SL3261为201±46 CFU、SL3261-pIRES2-EGFP为163±37,而SL3261-pIRES2-EGFP-4-1BBL为158±32,含质粒SL3261在体外感染HepG2细胞的能力同原细菌基本相同(P＞0.05).感染含质粒SL3261的HepG2细胞观察到GFP表达,感染含重组质粒SL3261的HepG2细胞经RT-PCR检测到约930 bp的目的条带.结论:成功构建了能携带大鼠4-1BBL基因真核表达质粒的SL3261疫苗菌.
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树突状细胞感染PSMA/4-1BBL基因重组腺病毒后的免疫功能变化
目的:观察复制缺陷型腺病毒介导的人前列腺特异性膜抗原(prostate specific membrane antigen,PSMA)基因和肿瘤坏死因子配体超家族成员4-1BB配体(4-1BB ligand,4-1BBL)基因体外共同感染的树突状细胞(dendritic cell,DC)的免疫学功能变化.方法:Ad-GFP空载体感染未成熟DC,确定适MOI.将感染的健康志愿者外周血来源DC分为Ad-PSMA/4-1BBL-DC组(共感染组)、Ad-PSMA-DC组、Ad4-1BBL-DC组、Ad-GFP-DC组以及未感染DC组,荧光倒置显微镜观察DC的形态学变化,流式细胞仪分析CD80、CD83、CD86等表型变化,Western blotting检测DC上PSMA和4-1BBL蛋白的表达,ELISA法检测各组DC上清的IL-12水平,CCK-8法检测各组DC刺激自体T淋巴细胞增殖能力及对人前列腺癌细胞株LNCap、Du145和22RV的细胞毒作用.结果:确定佳MOI为200.共感染组DC表面CD80、CD83、CD86、HLA-DR共刺激分子均上调,明显高于未感染DC组[(38.72±0.99)％、(44.65±0.77)％、(63.60±0.75)％、(62.25 ±0.58)％ vs (28.27±1.04)％、(28.08±1.16)％、(41.05±1.33)％、(46.87±1.12)％；P＜0.05].共感染组IL-12分泌水平明显高于单个基因重组腺病毒感染组及未感染组[(134.29±2.22)vs(79.51±1.60)、(70.33±1.13)、(69.67±1.43)、(28.88±2.97) pg;P＜0.05].DC:T同一比例下,共感染组刺激自体T细胞增殖能力明显高于单感染组及未感染组(P＜0.05).PSMA/4-1BBL-DC-CTL对PSMA阳性的LNCap细胞的杀伤率明显高于对另两种PSMA阴性细胞DU145、22RV的杀伤率(P＜0.05),也明显高于PSMA-DC-CTL组、4-1BBL-DC-CTL组的杀伤率(P＜0.05).结论:Ad-PSMA/4-1BBL感染后,DC不但高分泌IL-12,还能刺激和增强肿瘤特异性CTL对PSMA阳性前列腺癌细胞的杀伤作用；Ad-PSMA和Ad-4-1BBL共感染DC较单一感染DC能更有效诱导肿瘤特异性CTL.
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重组腺病毒介导hPSMA和4-1BBL基因转染小鼠树突状细胞的变化及临床意义
目的:研究hPSMA和4-1BBL基因转染小鼠树突状细胞(DC)后的变化及其在前列腺癌方面的临床意义.方法:以含hPSMA和4-1BBL基因的重组腺病毒载体转染C57BL/6j小鼠骨髓来源的DC,将培养的DC分为阳性组(Ad/hPSMA-IRES-m4-1BBL组)、阴性对照组(Ad5LacZ组)和未转染组,分别加入重组腺病毒、空载质粒腺病毒和生理盐水后,采用流式细胞仪测定腺病毒的转染效率;用相差显微镜、扫描电镜和透视电镜观察DC的形态学变化;用流式细胞仪分析表型变化;用Western blot检测DC hPSMA蛋白的表达.结果:经体外诱导培养后获得的树突状细胞在相差显微镜、透视电镜和扫描电镜下均观察到具有典型形态的成熟DC;流式细胞仪检测腺病毒转染效率为70%,Ad/hPSMA-IRES-m4-1BBL组DC细胞表面MHC-Ⅱ、CD80、CD86较其余两组无明显差异(P＞0.05),但4-1BBL有明显提高(P＜0.05);Western blot检测DC蛋白表达出PSMA.结论:本实验中获得的DC具有成熟DC的典型特征,DC表面的4-1BBL表达率明显上调,表达出PSMA蛋白.本研究将为DC应用于前列腺癌的生物治疗奠定基础.
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PSMA/4-1BBL共转染DC疫苗联合CIK细胞体外抑制前列腺癌的实验研究
目的:本研究通过复制缺陷性腺病毒介导的人前列腺特异性膜抗原基因(PSMA)和肿瘤坏死因子配体超家族成员(4-1BBL)体外共同转染树突状细胞(DC)后,与细胞因子诱导的杀伤细胞(CIK)共培养,观察其体外抑制前列腺癌的生物学效应.方法:将Ad-PSMA、Ad-4-1BBL、Ad-GFP按MOI=200∶1转染DC作为刺激细胞,分为共转染组、PSMA转染组、4-1BBL转染组、阴性对照组(Ad-GFP-DC组)以及未转染DC组,Western blot法检测各组DC细胞中PSMA和4-1BBL蛋白的表达；流式细胞仪分析CD80、CD83、CD86等表型变化；取患者外周静脉血单个核细胞中淋巴细胞用于CIK细胞的诱导培养,按DC∶ CIK=1∶10比例将上述不同转染组DC加入CIK中,共同孵育96h(设普通DC刺激组和单独CIK细胞组为对照),收获的细胞作为效应细胞,流式细胞仪测定不同DC刺激组CIK细胞CD3、CD56表达率,ELISA法检测不同DC-CIK组培养上清IFN-γ、IL-10水平；PE-7AAD凋亡试剂盒检测不同DC-CIK组对人前列腺癌细胞株LNCap、Du145的细胞毒作用.结果:Western blot结果证实PSMA、4-1BBL可在DC上成功表达；各转染组DC表面CD80、CD83、CD86、HLA-DR共刺激分子表达上调,与未转染组相比较差异显著(P＜0.05).培养14d,不同DC疫苗刺激组CIK以及单独CIK细胞组中CD3+、CD56+、CD3 +/CD56+T细胞比例均高于培养7d的CIK,差异显著(P＜0.05),其中经不同DC疫苗刺激的CIK组上升较单独培养14d-CIK组更明显(P＜0.05).DC-CIK培养上清中PSMA/4-1BBL-DC-CIK组IFN-γ分泌量高,达1176.10±14.37pg/5×106cells,IL-10分泌量低,为75.14 ±2.01 pg/5×106cells,与其他各组比较,差异显著(P＜0.05).不同组别DC-CIK作用于LNCap、Du145细胞24h后,荧光显微镜下观察细胞凋亡和坏死明显.同一组别DC疫苗刺激下的CIK细胞对LNCap的杀伤作用强于DU145细胞,差异显著(P＜0.05).而在针对同一种肿瘤细胞时,PSMA/4-1BBL-DC-CIK组的杀伤作用强,LNCap细胞的凋亡率可达(24.56 ±1.68)％,Du145细胞凋亡率可达(12.67±0.94)％,与PSMA-DC-CIK组、4-1BBL-DC-CIK组相比,差异显著(P＜0.05),而PSMA-DC-CIK和4-1BBL-DC-CIK组的前列腺癌细胞的凋亡率则无显著差异(P＞0.05),但与GFP-DC-CIK、普通DC-CIK、和单独CIK组相比差异显著(P＜0.05).结论:本实验中Ad-PSMA/4-1BBL高效转染的DC具有成熟DC的典型特征,与CIK共培养后提高了CD3 +/CD56+T细胞比例,IFN-γ分泌量显著增高,并增加了对PSMA阳性靶细胞的特异性杀伤,比普通DC-CIK及单独CIK具有更强的杀伤活性.两种肿瘤相关抗原转染DC与CIK共培养后可以更有效地提高CIK细胞的杀伤活性.
