首页 > 文献资料
-
多主枝孢霉重组变应原Cla h8的制备及其免疫活性鉴定
目的:通过基因工程手段,获得重组多主枝孢霉变应原蛋白Cla h8,有利于进行变应原的标准化,为标准化抗原的临床特异性诊断与治疗奠定基础.方法:从多主枝孢霉菌体中提取总RNA,采用RT-PCR的方法扩增Cla h8编码基因,将其连入pET-19b载体.转入大肠杆菌BL21 Star (DE3)pLysS,经诱导表达后,进行提纯复性,用Western blot和Dot-blot检测其免疫活性.结果:重组多主枝孢霉变应原Cla h8蛋白可以与多主枝孢霉过敏患者的血清中IgE和IgG抗体特异性结合,与天然蛋白具有相似的免疫活性.结论:制备并获得了具有生物学活性的可溶性重组多主枝孢霉变应原Cla h8蛋白,可用于多主枝孢霉变应原的标准化,克服天然提取物的非单一性及标准化难的障碍.
关键词： 多主枝孢霉 重组变应原Cla h8 蛋白表达 变应原活性 -
美洲大蠊精氨酸激酶基因的克隆、表达及变应原活性测定
目的 克隆美洲大蠊 (Periplaneta americana) 精氨酸激酶 (arginine kinase,AK) 基因并表达、纯化具有变应原活性的重组AK. 方法提取美洲大蠊总RNA,设计特异引物,通过RT-PCR克隆美洲大蠊AK基因目的 片段.测序后将该片段克隆入原核表达载体pET-28a,转化至大肠埃希菌 (E.coli) BL21(DE3),经异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达,获重组AK.用镍离子 (Ni2+)亲和层析柱纯化,经十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳 (SDSPAGE) 分析重组AK表达情况.用蛋白质印迹分析(Western blotting)(变性条件)和ELISA(非变性条件)检测霞组AK变应原与过敏患者血清IgE结合活性,并以健康人血清为对照. 结果测序结果表明,AK基因含有1068 bp的开放阅读框,编码356个氨基酸(登录号为EU429466).与GenBank公布的序列(登录号为AY563004)比较同源性达99.9%.SDS-PAGE分析表明,该变应原基因在E.coli中主要以可溶形式高水平表达,相对分子质量约为Mr45000.重组变应原AK在变性与非变性条件下,与过敏患者血清IgE均具有良好的结合活性,与健康人对照组之间的差异具有统计学意义(P＜0.05). 结论获得了具有变应原活性的重组美洲大蠊精氨酸激酶.
